郁金鳳

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院輸血科，江蘇 南京 210008）

研究表明，拜阿司匹林聯(lián)合P2Y受體拮抗劑的抗血小板治療對(duì)改善急性期腦梗死患者的預(yù)后和降低復(fù)發(fā)率至關(guān)重要[1]。氯吡格雷是國(guó)內(nèi)常用的P2Y受體拮抗劑，然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)部分患者常規(guī)服用氯吡格雷后仍有發(fā)生血栓事件的風(fēng)險(xiǎn)[2]，分析原因顯示，CYP2C19基因多態(tài)性是造成氯吡格雷反應(yīng)變異性的原因之一，既往研究顯示，攜帶1 種或2 種CYP2C19變異等位基因的患者將氯吡格雷轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物的能力降低[3]，因此，CYP2C19基因多態(tài)性是在基因?qū)用鏇Q定氯吡格雷治療對(duì)血小板功能影響的重要原因。目前有多種方法可檢測(cè)血小板功能，PFA-200 P2Y法是近年來(lái)新興的血小板功能檢測(cè)方法，被用于氯吡格雷的藥效檢測(cè)。有研究評(píng)估了PFA-200 P2Y法與其他常用血小板功能檢測(cè)方法對(duì)口服氯吡格雷患者血小板功能檢測(cè)結(jié)果的差異[4-5]，但CYP2C19基因多態(tài)性聯(lián)合PFA-200 P2Y法評(píng)價(jià)氯吡格雷臨床療效的相關(guān)性研究較少?；诖?，本研究探究PAF-200 P2Y和LTA兩種方法檢測(cè)氯吡格雷治療后的血小板功能，進(jìn)而評(píng)估CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷臨床療效的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性研究分析2018 年1 月至2018 年12月就診于本院的72 例急性期腦梗死患者的臨床資料，其中男43 例，女29 例；年齡20～89 歲，平均（64.03±11.34）歲?；颊呒覍倬鶎?duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中國(guó)急性缺血性腦卒中診療指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；發(fā)?。?4 d；年齡＞18歲；頭顱CT 或MRI 診斷有新發(fā)腦梗死。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在氯吡格雷或阿司匹林過(guò)敏史；NHISS＞18分；近3個(gè)月有嚴(yán)重的出血性疾病、嚴(yán)重外傷、手術(shù)患者；服用對(duì)血小板功能有影響的藥物；妊娠期或哺乳期患者；嚴(yán)重肝腎功能損傷，腎小球?yàn)V過(guò)率（eGFR）＜20 mL/（min·1.73m2）；血小板計(jì)數(shù)（PLT）≤100×109/L，紅細(xì)胞壓積（HCT）＜30%。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料采集 采集患者基本資料及腦血管疾病相關(guān)危險(xiǎn)因素，包括性別、年齡、身高、體重指數(shù)、個(gè)人史、既往病史、用藥情況、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、住院時(shí)間、有無(wú)急性期并發(fā)癥等內(nèi)容。

1.2.2 主要試劑與儀器 小板功能分析儀PFA-200 及配套INNOVANCE PFA P2Y 試劑盒（德國(guó)SIEMENS），CRONO-LOG Model 700 血小板聚集儀及ADP 試劑（美國(guó)CHRONO-LOG），3.2%枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管。

1.2.3 PFA-200 P2Y檢測(cè)血小板閉合時(shí)間 嚴(yán)格按照產(chǎn)品配套說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，首先查看觸發(fā)液是否足夠，待儀器加熱至37 ℃，進(jìn)行自我測(cè)試。之后，將800 μL枸櫞酸鈉抗凝全血加入到P2Y試劑盒中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄為血小板閉合時(shí)間CT（單位s）。＞300 s的檢測(cè)結(jié)果儀器顯示為“non-closure”，為便于統(tǒng)計(jì)分析，將“non-closure”結(jié)果記錄為300 s。

1.2.4 LTA檢測(cè)ADP誘導(dǎo)的最大血小板聚集率（LTA-ADPMAX）取3.2%枸櫞酸鈉抗凝靜脈血，首先1 500 g離心15 min獲得富血小板血漿（platelet rich plasm，PRP），取500 μL加入反應(yīng)杯中；剩余標(biāo)本1 500 g離心15 min獲得貧血小板血漿（platelet poor plasm，PPP）。以PPP為參照，在PRP中加入ADP誘導(dǎo)劑（終濃度5 μmol/L）誘導(dǎo)血小板聚集，透光度改變的最大值記錄為最大血小板聚集率（LTA-ADPMAX）。

1.2.5 氯吡格雷抵抗（CR）診斷標(biāo)準(zhǔn)及分組 以傳統(tǒng)血小板功能檢測(cè)方法LTA（吸光度比濁法）為檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)Agarwal等相關(guān)研究結(jié)果，將LTA-ADPMAX＞50%定義為CR[6]。

1.2.6 CYP2C19 基因檢測(cè) CYP2C19 基因型檢測(cè)由本院病理科完成。根據(jù)CYP2C19 基因型結(jié)果，將CYP2C19 基因野生純合子*1/*1 定義為為氯吡格雷快代謝型（extensive metabolizers，EM）；野生型和突變基因雜合子*1/*2 或*1/*3為氯吡格雷中間代謝型（intermediate metabolizers，IM），將純合子突變*2/*2、*3/*3、雜合雙突變*2/*3 定義為慢代謝型（poor metabolizers，PM）。

1.3 觀(guān)察指標(biāo) 所有患者均服用氯吡格雷＞3 d 后，采用PFA-200 P2Y、LTA兩種方法測(cè)定血小板功能。分析CYP2C19基因多態(tài)性與血小板功能檢測(cè)結(jié)果、CR 發(fā)生率及住院時(shí)間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Pearson 相關(guān)系數(shù)和簡(jiǎn)單線(xiàn)性回歸分析PFA200、LTA檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組臨床資料比較 根據(jù)CYP2C19 基因型結(jié)果分為快代謝組（EM 組，n=27）、中間代謝組（IM 組，n=32）、慢代謝組（PM 組，n=13），占比分別為37.5%、44.4%、18.1%，其中45 例（62.5%）患者攜帶CYP2C19*2 或*3 等位基因突變。3 組患者年齡、性別、BMI、吸煙史、既往史、實(shí)驗(yàn)室檢查等臨床資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 3組臨床資料比較Table1 Comparison of clinical date among three groups

2.2 3 組PFA-200 法與LTA 法檢測(cè)CR 發(fā)生率比較 EM 組患者PFA200 P2Y 檢測(cè)的血小板功能閉合時(shí)間為（287.04±46.03）s，長(zhǎng)于IM 組（226.66±93.43）s 和PM 組（189.00±117.21）s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EM 患者LTA 法檢測(cè)ADP 誘導(dǎo)的最大血小板聚集率為（47.74±22.97）%，低于IM組（53.11±26.01）%和PM組（69.00±17.95），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PFA-200 P2Y 檢測(cè)法和LTA 法均顯示EM組、IM 組和PM 組CR 發(fā)生率分別為11.1%、15.6%、46.2%和44.1%、50.0%、92.3%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 PFA-200 P2Y 與LTA 血小板功能檢測(cè)相關(guān)性分析Pearson 相關(guān)性和簡(jiǎn)單線(xiàn)性回歸分析顯示，PFA-200 P2Y 與LTA 檢測(cè)結(jié)果呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.365，P=0.001），回歸方程為PFA（s）=312.65-1.41LTA（%）。

2.4 3組患者住院時(shí)間比較 EM組、IM組和PM組患者住院時(shí)間分別為（11.04±3.31）、（11.31±3.97）、（10.77±5.24）d，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

抗血小板治療是急性期腦梗死的特異性治療方法之一，氯吡格雷作為一種抗血小板藥物已廣泛應(yīng)用于腦梗死的治療。POINT 研究顯示，發(fā)病早期（12 h 內(nèi)）使用阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷治療90 d可降低缺血性卒中復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[7]。然而，氯吡格雷的效果存在個(gè)體差異，部分患者對(duì)氯吡格雷反應(yīng)低下，稱(chēng)為氯吡格雷抵抗。在研究氯吡格雷抵抗的各種機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450酶同工酶系統(tǒng)中的CYP2C19基因在氯吡格雷的代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用。氯吡格雷為血小板P2Y12受體拮抗劑，本身是一種無(wú)藥理活性的前體藥物，經(jīng)消化道吸收后，約85%的藥物在腸道被酯酶水解為無(wú)活性物質(zhì)，15%經(jīng)肝臟CYP450酶介導(dǎo)的兩步氧化過(guò)程代謝為活性產(chǎn)物。其活性代謝產(chǎn)物通過(guò)與血小板表面受體P2Y12 結(jié)合抑制血小板的活化和聚集，從而發(fā)揮抗血栓作用。CYP2C19基因在氧化過(guò)程中均發(fā)揮作用[8]。

CYP2C19基因具有高度多態(tài)性。Zhang等[9]研究顯示，亞洲人群中CYP2C19*2、CYP2C19*3 變異等位基因攜帶者比例達(dá)60%，明顯高于高加索人群（約30%）。本研究中CYP2C19*2、*3 變異等位基因攜帶者比例為62.5%，與上述報(bào)道類(lèi)似。既往研究顯示攜帶CYP2C19 功能缺失型等位基因的患者口服氯吡格雷治療PCI 術(shù)后心肌梗死患者具有更高的心血管事件發(fā)生率[10]，而在腦梗死患者中，Jia 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19 基因多態(tài)性對(duì)氯吡格雷抵抗的發(fā)生和疾病的預(yù)后有很大影響，Sun等[12]研究顯示，攜帶CYP2C19功能缺失型等位基因的腦梗死患者具有發(fā)生心血管事件的高風(fēng)險(xiǎn)，因此，對(duì)于服用氯吡格雷抗血小板的腦梗死患者，檢測(cè)CYP2C19基因型顯得尤為必要。本研究發(fā)現(xiàn)3 種代謝類(lèi)型患者CR 發(fā)生率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與既往報(bào)道結(jié)果類(lèi)似[13]。3種代謝類(lèi)型住院時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但由于隨訪(fǎng)時(shí)間較短，本研究并未分析不同代謝類(lèi)型與急性期腦梗死患者再發(fā)心腦血管不良事件的關(guān)系。

為觀(guān)察血小板對(duì)氯吡格雷治療的反應(yīng)性，目前臨床上應(yīng)用多種檢測(cè)方法檢測(cè)血小板功能。最常用的血小板功能檢測(cè)方法有LTA、VerifyNow、TEG、流式細(xì)胞術(shù)及PFA-200 P2Y法等[14]。本研究采用LTA、PFA-200 P2Y 兩種方法評(píng)估血小板的功能。LTA是最早應(yīng)用于臨床檢測(cè)血小板功能的方法，目前仍被認(rèn)為是血小板功能檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。LTA 通過(guò)測(cè)量ADP 誘導(dǎo)的富血小板血漿的光學(xué)透光度改變?cè)u(píng)估血小板功能。本研究顯示通過(guò)LTA 方法可發(fā)現(xiàn)不同代謝類(lèi)型氯吡格雷藥效比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PFA-200 P2Y 是近年來(lái)新興的血小板功能檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)便、所需時(shí)間短、樣本量少、無(wú)需繁瑣分析前樣本準(zhǔn)備等優(yōu)點(diǎn)，PFA-200 P2Y 檢測(cè)方法可模擬體內(nèi)血管損傷時(shí)，高剪切力下血小板的粘附和聚集功能，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。Lim等[15]研究顯示，PFA-200 P2Y檢測(cè)的血小板功能閉合時(shí)間（Cut-off值=106 s）可以作為急性冠脈綜合征患者再發(fā)心臟不良事件的預(yù)測(cè)指標(biāo)。而B(niǎo)reet等[16]研究顯示通過(guò)PFA-100檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HPR（Cut-off值=236 s）與支架內(nèi)血栓、缺血性梗死等臨床不良結(jié)局之間并無(wú)相關(guān)性。在急性腦梗的臨床研究中，目前并沒(méi)有臨床報(bào)道顯示PFA-200 P2Y 檢測(cè)結(jié)果與腦梗臨床預(yù)后的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，與其他血小板功能檢測(cè)方法相比，EM、IM、PM 3種代謝類(lèi)型PFA-200 P2Y檢測(cè)值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過(guò)定義血小板閉合時(shí)間Cut-off 值為106 s，本研究發(fā)現(xiàn)3種不同代謝類(lèi)型氯吡格雷抵抗發(fā)生率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，PFA-200 P2Y檢測(cè)方法與LTA檢測(cè)方法具有中等程度的相關(guān)性。由于PFA-200 P2Y檢測(cè)的最大閉合時(shí)間為300 s，超過(guò)300 s就顯示為non-closure，對(duì)于PFA-200 P2Y檢測(cè)的最佳Cut-off值各研究之間報(bào)道也存在差異[17],且有可能相關(guān)研究樣本量較少，目前僅有少數(shù)研究顯示PFA-200 P2Y檢測(cè)方法與其他血小板功能檢測(cè)方法具有良好的相關(guān)性[4，18]，因此，未來(lái)需要更多的臨床樣本評(píng)估PFA-200 P2Y檢測(cè)血小板功能的敏感性和特異性。根據(jù)CYP2C19基因多態(tài)性，本研究未納入超快代謝型患者，未來(lái)需進(jìn)一步增加研究的樣本量，延長(zhǎng)患者的隨訪(fǎng)時(shí)間，評(píng)估PFA-200 P2Y的檢測(cè)的血小板功能與急性期腦梗死患者預(yù)后的關(guān)系。

綜上所述，約62.5%的接受氯吡格雷治療的急性期腦梗死患者攜帶CYP2C19*2、*3變異等位基因，PFA-200 P2Y檢測(cè)血小板功能發(fā)現(xiàn)氯吡格雷臨床療效與CYP2C19 基因型之間有明顯相關(guān)，可為臨床治療提供依據(jù)。