王迪,王智榮,陳湑慧,宋軍,孔祥兵,陳本開,闞建全*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶),重慶,400715)3(中匈食品科學(xué)合作研究中心,重慶,400715)4(重慶市永川區(qū)君意食品廠,重慶,402160)

豆豉是將黃豆或黑豆經(jīng)過浸泡、蒸煮和微生物發(fā)酵等工藝制成的一種風(fēng)味食品,因其滋味獨(dú)特而深受消費(fèi)者的喜愛。在豆豉的生產(chǎn)工藝中,后發(fā)酵是其外觀變化、風(fēng)味物質(zhì)生成、生物活性增強(qiáng)、營養(yǎng)成分變化的重要工序。在此階段,豆豉中的還原糖和氨基酸進(jìn)行非酶促褐變反應(yīng)生成類黑精[1],使得豆豉的顏色逐漸向黑色轉(zhuǎn)化,且在微生物酶系作用下,豆豉的蛋白質(zhì)和纖維素發(fā)生水解,硬度和咀嚼度不斷降低[2],滋味也由蒸煮后的奶香[3]向鮮味、甜味、苦味等滋味[4]轉(zhuǎn)變。與此同時(shí),大豆浸泡蒸煮后產(chǎn)生的20多種揮發(fā)性成分[3]經(jīng)過后發(fā)酵后可增至60～80種[5],且后發(fā)酵后豆豉的游離氨基酸(free amino acids,FAA)總量、總酸(total acids,TA)和維生素B2等含量明顯增高[6-7]。此外,豆豉在后發(fā)酵過程中產(chǎn)生的類黑精[1]和大豆多肽[8]等物質(zhì),具有抗氧化[9]及抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性作用[10]等多種生物活性,有利于促進(jìn)人體健康。

研究認(rèn)為,氨基酸態(tài)氮(amino nitrogen,AN)含量可以反映出豆豉中蛋白質(zhì)的水解程度,其含量是判斷豆豉后發(fā)酵是否完成的重要指標(biāo)[11-12]。因此,研究AN生成動(dòng)力學(xué),將有利于減少工業(yè)生產(chǎn)成本,提高生產(chǎn)效率。目前,關(guān)于豆豉后發(fā)酵的研究主要集中后發(fā)酵工藝的優(yōu)化和某一溫度下理化性質(zhì)的變化,但對(duì)于不同后發(fā)酵溫度對(duì)豆豉的品質(zhì)影響研究較少,尤其是不同溫度下AN的生成動(dòng)力學(xué)。近年來,修正后的Gompertz方程為描述豆豉后發(fā)酵過程中AN的動(dòng)力學(xué)過程提供了新的思路,該方程已成功描述了多種發(fā)酵過程的產(chǎn)物的動(dòng)力學(xué)變化[13-14]。

在豆豉工業(yè)生產(chǎn)中,根據(jù)不同工藝要求,曲霉型豆豉通常在45～60 ℃中的某一溫度下進(jìn)行保溫后發(fā)酵。然而,在實(shí)際生產(chǎn)中,豆豉發(fā)酵程度往往依托于工人的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷,因此,本文以4種大豆(3種黃豆和1種黑豆)為原料,米曲霉為發(fā)酵菌種,使用修正后的Gompertz方程擬合45、55和65 ℃溫度下AN的含量,評(píng)估不同溫度下AN的最大值以及最大生成速率,同時(shí)探討AN最大值和最大生成速率與溫度的關(guān)系。此外,監(jiān)測(cè)3種溫度下豆豉的pH值、水分、褐變指數(shù)(browning index,BI)、TA及FAA的含量變化,并對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,旨在為曲霉型豆豉生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4種市售大豆：重慶本地大豆(渝豆6號(hào),文中縮寫為LS),重慶市永輝超市；東北大粒大豆(東生7號(hào),文中縮寫為DBL)、黑豆(青仁烏,文中縮寫為BS),黑龍江省大興安嶺市當(dāng)?shù)爻?；東北小粒大豆(東生1號(hào),文中縮寫為DBS),黑龍江省哈爾濱市當(dāng)?shù)爻?；米曲?滬釀3.042菌種),山東濟(jì)寧玉園生物科技公司；醪糟、食鹽,永輝超市。

賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)、胱氨酸(Cys)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、蛋氨酸(Met)、蘇氨酸(Thr),Sigma公司；1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液,Aladdin 公司;甲醛溶液、鹽酸、三乙胺醋酸鈉、乙腈,成都市科隆化學(xué)品有限公司；2,4-二硝基氟苯,成都科龍化工試劑廠,其中乙腈為色譜級(jí),其余均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WR-18威福光電色差儀,深圳市威福光電科技有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀,美國Agilent公司；FS-2可調(diào)高速勻漿機(jī),江蘇金壇科析儀器有限公司；DCX—9243 B-1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PB-10 pH計(jì)、SQP電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RCT basic package磁力攪拌器,德國IKA公司；LHS-150CLY恒溫恒濕箱,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 曲霉型豆豉的制備

曲霉型豆豉的工藝及條件如下所示：

挑選大豆→浸泡 (25 ℃,12 h) →瀝干→蒸煮 (常壓蒸煮,2 h) →冷卻→接種 (0.04%米曲霉) →制曲 (30 ℃,85%相對(duì)濕度,48 h) →拌料 (8%食鹽、10%醪糟) →后發(fā)酵 (45、55、65 ℃)→豆豉

將拌勻后的曲料分裝在無菌密封袋中,分別放在45、55及65 ℃的恒溫箱中進(jìn)行后發(fā)酵,并于0、2、4、7、10、14、18、22 d分別取樣并進(jìn)行相關(guān)理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 水分含量的測(cè)定

參考COSTA等[15]的方法并作適當(dāng)修改,先稱空白鋁盒的質(zhì)量記為m1,再稱取5 g左右豆豉于鋁盒中記為m2,再放置在105 ℃下烘16 h,烘后質(zhì)量記為m3,按公式(1)計(jì)算水分含量：

(1)

1.3.3 pH值的測(cè)定

參考張仁鳳[11]的方法。取5 g樣品加入40 mL蒸餾水并用勻漿機(jī)破碎,7 500 r/min離心10 min,離心后將上清液移至50 mL容量瓶并定容,用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.4 TA的測(cè)定

取5 g豆豉加入50 mL 蒸餾水并用勻漿機(jī)分散均勻,定容到100 mL,按照GB/T 12456—2008[16]中總酸的方法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果以乳酸計(jì)。

1.3.5 AN的測(cè)定

樣品制備方法與總酸測(cè)定相同,樣品制備好后按照GB 5009.235—2016[17]測(cè)定AN的含量。

1.3.6 BI的測(cè)定

使用色差計(jì)直接測(cè)定豆豉的顏色,即L*、a*和b*值,按公式(2)計(jì)算BI[18]：

(2)

(3)

1.3.7 FAA的測(cè)定

(1) FAA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別準(zhǔn)確稱取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品各4 mg于5 mL 的棕色容量瓶中,用0.1 mol/L的HCl溶液定容。分別吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用0.1 mol/L的HCl溶液稀釋,制成一系列濃度的混合溶液。

(2) 豆豉樣品的制備。參考梁葉星等[19]的方法并作適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱取豆豉樣品5 g,加入20 mL 0.1 mol/L HCl溶液,用勻漿機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行破碎,將破碎后的樣品溶液放置在25 ℃、160 r/min 振蕩搖床中振蕩提取1 h,8 000 r/min離心15 min,過濾至50 mL容量瓶,在濾渣中按照上述方法重復(fù)提取1次,合并濾液最后定容。

(3) FAA的柱前衍生和HPLC測(cè)定條件。將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和豆豉樣品參照文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行柱前衍生,衍生結(jié)束后經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾,取濾液后HPLC上機(jī)分析。

1.3.8 數(shù)學(xué)模型

修正后的Gompertz方程如公式(4)所示[13]：

(4)

式中：Pm,AN的最大值,g/100 g；tz,滯后時(shí)間,h；km,生成速率,g/h；t,后發(fā)酵時(shí)間,d。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析及處理

以上指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次。使用Microsoft Excel 2019處理數(shù)據(jù),Origin pro 2019b繪制圖形和擬合方程,Minitab 19進(jìn)行顯著性分析,SPSS 25進(jìn)行相關(guān)性分析,確定系數(shù)(R2)和誤差平方和(sum of squares due to error,SSE)對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同后發(fā)酵溫度下曲霉型豆豉的AN生成動(dòng)力學(xué)

如圖1所示,在后發(fā)酵過程中,4種大豆在3種溫度下AN含量總體呈現(xiàn)出先上升后逐漸趨于穩(wěn)定最終有所下降的趨勢(shì),發(fā)酵前期的上升后趨于穩(wěn)定是因?yàn)殡S著后發(fā)酵的不斷進(jìn)行,總蛋白酶活力逐漸下降,從而導(dǎo)致AN的增速逐漸變慢[7,21]；發(fā)酵22 d AN含量下降可能是豆豉內(nèi)某些生化反應(yīng)消耗所導(dǎo)致的。同時(shí),不同后發(fā)酵溫度下AN的含量不同,這可能是因?yàn)楹蟀l(fā)酵的溫度影響了蛋白酶的活力,溫度越高,蛋白酶活力越低。值得注意的是,4種豆豉在65 ℃下,后發(fā)酵前期AN含量有明顯的下降,這可能是因?yàn)樵诖藴囟葪l件下,蛋白酶活力很低,氨基酸的消耗量遠(yuǎn)大于產(chǎn)生量。

a-LS;b-DBL;c-DBS;d-BS圖1 不同后發(fā)酵溫度下4種曲霉型豆豉的AN含量Fig.1 AN content of four Aspergillus-type Douchi at different post-fermentation temperatures

由圖1可知,4種豆豉在發(fā)酵18 d的AN含量達(dá)到最高,故將18 d作為豆豉發(fā)酵的終點(diǎn)。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定曲霉型豆豉AN含量需高于0.4 g/100 g,本文所研究的各溫度下AN終點(diǎn)含量均符合該要求。為了更好地探索溫度和AN的關(guān)系,剔除了65 ℃下0 d的值,使用修正后的Gompertz方程擬合了4種大豆在3種溫度下的AN含量,擬合結(jié)果如表1所示,擬合曲線如圖2所示。

表1中，R2均大于0.94,故該方程可以很好地?cái)M合不同溫度下后發(fā)酵過程中AN的生成;4種豆豉在同一溫度Pm和km基本無差異,這說明大豆品種對(duì)于后發(fā)酵期間AN的生成無明顯影響。4種曲霉型豆豉Pm和km均隨著溫度的升高而降低。CHOACHAMNAN等[22]使用Arrhenius方程描述km和T(K)之間的關(guān)系,本文使用線性回歸描述Pm和后發(fā)酵溫度T(K)之間的關(guān)系,結(jié)果如表2所示。在45～65 ℃,km和發(fā)酵溫度之間也符合Arrhenius方程的關(guān)系,Pm和溫度有良好的線性關(guān)系。

表1 方程系數(shù)及擬合優(yōu)度表Table 1 Equation coefficients and goodness of fit

a-LS;b-DBL;c-DBS;d-BS圖2 不同后發(fā)酵溫度下4種曲霉型豆豉的AN實(shí)測(cè)值和擬合曲線Fig.2 Measured AN values and fitting curves of four Aspergillus-type Douchi at different post-fermentation temperatures

表2 模型系數(shù)和溫度的關(guān)系Table 2 Relationship between model coefficients and temperature

2.2 不同后發(fā)酵溫度下曲霉型豆豉的水分含量、pH及TA的變化

如圖3所示,4種大豆在不同溫度下的水分含量雖有波動(dòng)但無顯著差異,這可能是因?yàn)槎刽诤蟀l(fā)酵過程中處于密閉環(huán)境,無法與外界交換水分,在趙文鵬[23]和張仁鳳[11]的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。4種豆豉的水分含量略有差異可能是因?yàn)槠贩N不同。

由圖4可知,4種大豆的pH值在3個(gè)溫度下均呈現(xiàn)出短暫上升后下降的趨勢(shì),且在3種溫度下無較大差異,4種豆豉間的pH值無顯著的差異。如圖5所示,在3種溫度下,4種大豆的總酸含量整體呈現(xiàn)出先下降后緩慢上升最終趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。pH的上升和TA的下降可能是微生物生長消耗,后期pH的下降和TA上升可能是因?yàn)槎刽械牡鞍踪|(zhì)和脂肪等物質(zhì)被相關(guān)酶分解成有機(jī)酸、FAA及脂肪酸等酸性物質(zhì)[11]。對(duì)TA而言,不同溫度下,4種豆豉的TA含量呈現(xiàn)出一樣的趨勢(shì)：在45 ℃下含量最高,其次為55 ℃,65 ℃含量最低。這可能是在本文研究的溫度下,溫度越高,生成酸類物質(zhì)相關(guān)酶的酶活力越低。對(duì)比同一溫度下4種豆豉TA含量,發(fā)現(xiàn)DBL明顯高于其他3種,其次是BS、LS和DBS,后3種差異不是很大,這可能與大豆品種有關(guān)。

2.3 不同后發(fā)酵溫度下曲霉型豆豉的BI變化

由圖6可知,隨著后發(fā)酵的不斷進(jìn)行,4種豆豉BI值呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì),吳枚枚[12]也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。同時(shí)觀察出,后發(fā)酵溫度越高,BI值越大,這可能是因?yàn)闇囟仍礁?美拉德反應(yīng)越快[22],由此證明,后發(fā)酵的時(shí)間和溫度都會(huì)影響豆豉褐化。

2.4 不同后發(fā)酵溫度下曲霉型豆豉的FAA含量變化

本文測(cè)定了發(fā)酵終點(diǎn)(18 d)4種曲霉型豆豉在3種溫度下的FAA含量,結(jié)果如表3所示。由表可知,4種豆豉中都檢測(cè)出18種FAA。對(duì)比4種豆豉后發(fā)酵前后總FAA的含量,觀察到45 ℃和55 ℃的FAA含量大幅度增高,在65 ℃條件下,除黑豆的FAA含量有輕微上升以外,其余3種黃豆的FAA含量均輕微下降。同時(shí)除了Ala之外,其余氨基酸基本均隨著后發(fā)酵溫度的升高而降低。索化夷等[2]報(bào)道,Glu和Leu是大豆中的主要游離氨基酸,本文的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。4種豆豉中均含有除色氨酸以外的7種人體必需氨基酸[2],通過對(duì)比發(fā)酵前后必需氨基酸含量的變化,發(fā)現(xiàn)3種發(fā)酵溫度下其含量都在增加:在45 ℃下,LS、DBL、DBS和BS分別增加了4.1、4.6、6.3和6.7倍；在55 ℃下,分別增加了3.8、4.4、5.2和6.1倍；在65 ℃下,4種豆豉分別增加了1.4、1.8、2.1和2.5倍；對(duì)比發(fā)酵前4種豆豉的FAA總含量,發(fā)現(xiàn)3種黃豆的總含量無明顯差異且均高于黑豆的總含量,差異主要體現(xiàn)在Arg的含量不同；對(duì)比45和55 ℃下4種豆豉的游離氨基酸總含量,發(fā)現(xiàn)黑豆的總含量高于3種黃豆,主要體現(xiàn)在Glu的含量不同；但在65 ℃下沒有發(fā)現(xiàn)4種豆豉的總含量有明顯差異。通過對(duì)比發(fā)酵前4種豆豉的必需氨基酸含量,發(fā)現(xiàn)LS最高,其次為DBL、DBS和BS。對(duì)比同一溫度下4種豆豉的必需氨基酸含量,發(fā)現(xiàn)在45和55 ℃下依舊是LS>DBL>DBS>BS,但在65 ℃下4種豆豉無明顯差異。

a-LS;b-DBL;c-DBS;d-BS圖3 不同后發(fā)酵溫度下4種曲霉型豆豉的水分含量Fig.3 Moisture content of four Aspergillus-type Douchi at different post-fermentation temperatures

a-LS;b-DBL;c-DBS;d-BS圖4 不同后發(fā)酵溫度下4種曲霉型豆豉的pH值Fig.4 pH value of four Aspergillus-type Douchi at different post-fermentation temperatures

a-LS;b-DBL;c-DBS;d-BS圖5 不同后發(fā)酵溫度下4種曲霉型豆豉的TA值Fig.5 TA value of four Aspergillus-type Douchi at different post-fermentation temperatures

a-LS;b-DBL;c-DBS;d-BS圖6 不同后發(fā)酵溫度下4種曲霉型豆豉的BI值Fig.6 Browning index of four Aspergillus-type Douchi at different post-fermentation temperatures

表3 四種曲霉型豆豉不同溫度下發(fā)酵前后游離氨基酸含量Table 3 Content of free amino acids before and after fermentation of four Aspergillus-type Douchi at different temperatures

續(xù)表3

秦禮康[24]將游離氨基酸分為以下幾種呈味氨基酸：甜味(Ala、Gly、Thr、Ser),鮮味(Glu、Asp),苦味(Met、Arg、Phe、Leu、His、Tyr、Val、Ile)及無味氨基酸(Pro、Cys、Lys)。由表4可知,在后發(fā)酵前后,鮮味和苦味氨基酸占了呈味氨基酸總量的80%及以上,甜味及無味氨基酸在呈味氨基酸中的占比差異不大。在后發(fā)酵前,4種豆豉的鮮味氨基酸占比略微高于苦味氨基酸；在后發(fā)酵結(jié)束后,3種黃豆豆豉中的苦味氨基酸明顯高于鮮味氨基酸；而黑豆中鮮味及苦味氨基酸占比差異不大。此外,鮮味氨基酸在呈味氨基酸中占比隨著后發(fā)酵溫度的升高而降低。

表4 不同溫度下4種曲霉型豆豉發(fā)酵前后呈味氨基酸在總氨基酸的占比Table 4 Proportion of flavored amino acids in total amino acids before and after fermentation of four Aspergillus-type Douchi at different temperatures

2.5 不同后發(fā)酵溫度下曲霉型豆豉各指標(biāo)的相關(guān)性分析

對(duì)4種曲霉型豆豉在45～65 ℃下后發(fā)酵期間(0～18 d)水分含量、BI值、pH、TA及AN含量進(jìn)行相關(guān)性分析,分析結(jié)果如表5所示。在4種曲霉型豆豉中各指標(biāo)間的相關(guān)性呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)：發(fā)酵溫度與BI值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與TA和AN呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),這可能是因?yàn)樵诒疚难芯康臏囟确秶鷥?nèi),溫度越高,生成類黑精的褐變反應(yīng)速度越快[7],生成有機(jī)酸和游離氨基酸的酶活力越低[12]。而水分含量和其余指標(biāo)的相關(guān)度比較低,這是因?yàn)榘l(fā)酵過程豆豉水分沒有顯著變化。BI值和pH值呈極顯著負(fù)相關(guān) (P<0.01),可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵的進(jìn)行,豆豉的BI值越來越高,樣品中的pH越來越低。本文研究了3個(gè)發(fā)酵溫度,發(fā)現(xiàn)豆豉顏色和AN沒有相關(guān)性；但僅對(duì)一種溫度下的豆豉顏色和AN進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)2個(gè)指標(biāo)呈現(xiàn)正相關(guān),這與韓佳冬[25]在永川豆豉的后發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)豆豉的顏色和AN的生成有顯著的相關(guān)性的結(jié)果類似。TA與AN呈極顯著正相關(guān) (P<0.01),張仁鳳[11]使用同種米曲霉在后發(fā)酵過程中也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果,這可能是因?yàn)樵诤蟀l(fā)酵過程中,TA和AN含量的增加都與其相關(guān)的酶有關(guān),而大部分酶的酶活力均呈下降趨勢(shì)[21]。

表5 不同指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between different indicators

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)修正后的Gompertz方程可以很好地描述4種曲霉型豆豉在不同后發(fā)酵溫度(45～65 ℃)下AN的生成動(dòng)力學(xué),觀察擬合后的參數(shù)發(fā)現(xiàn),AN的最大值和生成速率均隨著溫度的升高而降低,且AN的最大值與溫度呈線性關(guān)系,生成速率和溫度的關(guān)系符合Arrhenius方程,但4種豆豉的AN最大值和生成速率沒有差異。此外,后發(fā)酵溫度越高,4種豆豉的褐變程度越高,TA和AN含量越低,發(fā)酵結(jié)束后的游離氨基酸總量與必需氨基酸總量越低。本研究結(jié)果能準(zhǔn)確描述不同溫度下AN變化的動(dòng)力學(xué)方程,明確了不同溫度下曲霉型豆豉理化性質(zhì)的變化,為曲霉豆豉的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。