張淑萍 葛中東 張凱 夏宇欣 姜莉莉 樊兆斌*

（1，菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院 274000；2，菏澤學院藥學院 274715）

干擾素刺激基因（Interferon-stimulated genes，ISGs）是干擾素（IFN）下游的效應(yīng)分子，IFN 作用于靶細胞表面受體后，通過一系列信號傳導激活I(lǐng)SGs 的轉(zhuǎn)錄、表達[1，2]，在宿主免疫調(diào)節(jié)及抗病毒過程中發(fā)揮重要功能[3]。IFN 通過ISGs 發(fā)揮包括抗病毒、凋亡、抗增殖、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)在內(nèi)的多種細胞和生理功能[4]。不同的ISGs 可以針對病毒從入侵到釋放的不同階段發(fā)揮抑制作用[5]。以往針對ISGs 的研究主要集中在ISG15、Mx1、PKR 等[6-11]，對ISG12 的研究相對較少。ISG12 蛋白作為一個潛在的重要細胞因子，參與了機體的抗病毒過程。人巨細胞病毒（HCMV）、急性丙型肝炎病毒（HCV）感染后，ISG12表達水平均明顯提高[12]，禽流感病毒（AIV）感染能引起雞、鴨和小鼠體內(nèi)的ISG12 mRNA 水平明顯升高[13，14]。本研究通過RT-PCR 方法克隆了白來航雞ISG12 基因，并對其編碼蛋白進行生物信息學預測分析，研究結(jié)果為深入研究ISG12 編碼蛋白功能及其抗病毒的分子機制提供有價值的參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

動物組織總RNA 提取試劑盒、Fast Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒、2×Taq PCR Mastermix、D2000 Marker、凝膠回收試劑盒、DH5α 感受態(tài)、pGM-T 載體，質(zhì)粒小提試劑盒等均購自天根生化科技有限公司；LB 培養(yǎng)基購自Solarbio 公司。

1.2 試驗樣品

白來航雞的肝臟、脾臟組織。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank 已發(fā)表的原雞ISG12 基因序列（登錄號BN000223.1），利用primer premier 5.0 軟件設(shè)計白來航雞ISG12基因擴增引物ISG12-F/ISG12-R：ISG12-F:5'-ATGTCTGACCAG

AACGTCC-3'，ISG12-R：5'-GGACCGATGCTTCTTTCTA-3'，引物由華大基因有限公司合成。

1.4 ISG12 基因PCR 擴增

提取白來航雞總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，用引物ISG12-F/ISG12-R 進行目的基因擴增。PCR 反應(yīng)體系：cDNA 1μl，上游引物2μl，下游引物2μl，2×Taq PCR Master Mix 25μl，ddH2O 20μl，共50μl。PCR 反應(yīng)程序：94℃預計變性5min，94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共35 個循環(huán)；最后經(jīng)72℃延伸10min 后4℃保存。

1.5 PCR 產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化及測序

將PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收，16℃條件下連接pGMT 載體過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，涂布LB（A+抗性）固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個圓滑白色菌落于4ml LB（A+抗性）液體培養(yǎng)基，于37℃條件下180rpm 搖菌培養(yǎng)16h，后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。經(jīng)PCR 篩選陽性重組質(zhì)粒，選取3 個陽性克隆送華大基因公司進行序列測定。

1.6 ISG12 編碼蛋白理化特性及生物信息學分析

使用ProtParam 在線工具對ISG12 編碼蛋白理化特性進行預測分析。利用Protscale、TMHMM 2.0 等在線軟件分析ISG12編碼氨基酸序列的疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)。采用SignalP-5.0 Server預測蛋白信號肽，利用NetPhos3.1 Server，NetOGlyc 4.0 和Net-NGlyc 1.0 進行潛在磷酸化位點及潛在O、N 糖基化位點預測。利用在線分析軟件（http://Imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）進行抗原決定簇預測。

2 試驗結(jié)果

2.1 ISG12 基因PCR 擴增結(jié)果

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1 所示，擴增目的基因片段大小在400bp 左右，與預期結(jié)果一致。

圖1 ISG12 基因PCR 電泳結(jié)果

2.2 ISG12 基因核苷酸序列分析

將白來航雞ISG12 基因的核苷酸序列測序結(jié)果經(jīng)DNA Star軟件分析，結(jié)果表明，ISG12 基因編碼區(qū)為324bp，共編碼107個氨基酸。A（22.84%）、T（23.15%），G（27.47%）、C（26.54%），其中鳥嘌呤（G）含量最高。且（G+C）%為54.01%，提示ISG12 編碼蛋白為穩(wěn)定蛋白。

2.3 ISG12 編碼蛋白理化特性及生物信息學分析

使用ProtParam 在線工具對ISG12 基因編碼蛋白進行分析，結(jié)果顯示，白來航雞的ISG12 編碼蛋白理論分子量為10.28 kD，分子化學式為C418H690N134O154S7，理論等電點（PI）為10.18，脂肪指數(shù)為41.12，不穩(wěn)定系數(shù)為59.46，推測該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。經(jīng)對ISG12 基因編碼產(chǎn)物的親/疏水性分析預測，其疏水性圖譜如圖2 所示，整個多肽鏈有3 個明顯的親水區(qū)，該氨基酸序列內(nèi)超過半數(shù)為親水性殘基，整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，平均親水指數(shù)為-0.345。

圖2 ISG12 編碼蛋白親/疏水性預測

利用在線跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預測軟件TMHMM2.0 進行ISG12 編碼蛋白序列跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明，該蛋白不含跨膜區(qū)，均為胞外區(qū)。對ISG12 基因信號肽進行預測結(jié)果表明，該蛋白不含信號肽。潛在磷酸化位點預測結(jié)果見圖3，閾值0.5 時，ISG12 存在21 個潛在的磷酸化位點，其中包括17 個絲氨酸，分別位于肽鏈的第14、20、23、24、27、32、54、55、57、63、66、72、76、81、93、97 位和第99 位）和4 個蘇氨酸（位于肽鏈的第55、61、80 位和第94 位）。利用軟件NetOGlyc 4.0 和NetNGlyc 1.0 進行潛在O、N 糖基化位點預測，結(jié)果顯示ISG12存在6 個潛在的O-糖基化位點，分別位于第76、81、91、93、97 位和第99 位；不存在N-糖基化修飾位點?？乖瓫Q定簇預測結(jié)果表明，ISG12 編碼蛋白平均抗原傾向指數(shù)為0.9757，共含有3 個抗原決定簇區(qū)域，分別位于4～24，33～39 及78～88 位氨基酸。

圖3 ISG12 編碼蛋白磷酸化位點預測結(jié)果

3 討論

天然免疫系統(tǒng)是宿主抵抗病毒感染的第一道防線，宿主抗病毒應(yīng)答是宿主通過自身病原體模式識別受體識別病毒，誘導Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生而啟動。Ⅰ型干擾素通過激活JAK-STAT 信號通路，引起多種干擾素刺激基因（ISGs）的轉(zhuǎn)錄、表達，從而發(fā)揮抑制病毒復制、促進適應(yīng)性免疫應(yīng)答的功能。研究表明，ISGs 能有效靶向病毒復制周期的各個階段，抑制其復制，從而實現(xiàn)抗病毒作用。ISG12 由IFN-α 誘導表達，ISG12 基因?qū)儆贔AM14 家族，該家族成員為小的疏水蛋白質(zhì)，成員具有保守的ISG12 基序。研究表明，禽白血病病毒J 亞群（ALV-J）感染雞原代單核細胞衍生巨噬細胞(MDM) 后6h，ISG12 表達顯著上調(diào)，然而轉(zhuǎn)錄在36h 后開始下調(diào)[15]。H5N1和H9N1感染DF-1 細胞后，均引起ISG12 表達上調(diào)[16]。以上提示ISG12 是一個潛在的重要細胞因子，對其進一步研究有助于進一步理解其抗病毒作用機制。本研究成功擴增了白來航雞ISG12 基因，并對其進行了生物信息學預測分析，該結(jié)果為深入研究ISG12基因功能及其抗病毒機制提供了理論依據(jù)，為高效、安全的免疫佐劑研發(fā)提供了有價值的參考資料。