邱夢婕，李釗鋒，黎奕斌，陳玉柳，程宏彥，劉叔文，譚穗懿

南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州510515

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是獲得性免疫缺陷綜合征即艾滋病的致病因子；艾滋病是全球十大致命疾病之一，目前已經(jīng)造成了超過2 500 萬人死亡，有超過3 000 萬病毒攜帶者［1-2］。性傳播已成為HIV 感染的主要傳播方式［3］，其中精液是性傳播環(huán)節(jié)中的重要媒介。精液中含量較高的前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase，PAP）裂解所產(chǎn)生的多肽PAP248-286 可通過自組裝形成淀粉樣纖維，即精液來源的病毒增強因子（semen-derived enhancer of viral infection，SEVI），SEVI 能夠極大地促進HIV 感染［4-6］。抑制PAP248-286 形成SEVI，可以有效地抑制SEVI 對HIV 病毒感染的增強作用［7-9］。因此，SEVI成為預(yù)防HIV性傳播的新靶點。在我們前期篩選SEVI 小分子抑制劑的研究［8，10-12］中，意外地發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）可抑制PAP248-286聚合形成SEVI且精液中天然存在SOD，因此，本研究主要圍繞SOD 對PAP248-286生成的影響展開。

SOD 是帶負(fù)電荷的金屬蛋白酶，在人體內(nèi)可以清除超氧自由基，能消除代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)［13-14］。SOD 在臨床上有廣泛的用途，能治療因自由基損害引起的疾病［14］。SOD 在男性精液中普遍存在，但在不同疾病狀態(tài)的男性精液中其活性有所不同［15-20］。本研究使用多種生物物理化學(xué)方法，從不同層面探究SOD 對前體肽PAP248-286形成SEVI的抑制作用，探討其在精液中對人類免疫缺陷病毒1 型（HIV-1）感染的生理意義，為預(yù)防HIV的性傳播提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒 HEK-293T 人胚胎腎細(xì)胞、TZM-bl細(xì)胞（是一種攜帶有熒光素酶報告基因的傳代細(xì)胞系，并且該報告基因受HIV-1 Tat 原件調(diào)控，只有在HIV-1 Tat蛋白存在下才會表達(dá)，其熒光強度與HIV 滴度成正比）于本實驗室液氮中保存。感染性克隆病毒質(zhì)粒SF162（通過轉(zhuǎn)染能產(chǎn)生趨化因子受體CCR5 嗜性的HIV-1 克隆病毒）由烏爾姆大學(xué)Jan Münch教授惠贈。

1.1.2 精液的來源及處理 收集健康志愿者的精液（semen；seminal fluid，SE-F），室溫放置30 min，4 ℃，10 000×g離心30 min，取上清液，加入慶大霉素（50 μg/mL）、鏈霉素（100 U/mL）、青霉素（100 U/mL），存于?80 ℃待用。

1.1.3 主要試劑及儀器 SOD、總SOD 活性檢測試劑盒（上海碧云天），多肽PAP248-286（純度大于95%，北京中科亞光生物），轉(zhuǎn)染劑聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI，上海起福），細(xì)胞裂解液、熒光素酶檢測試劑盒（美國Promega），DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Gibco），電鏡碳膜銅網(wǎng)（上海主流貿(mào)易），3%磷鎢酸（上海君瑞生物），胎牛血清（FBS，上海依科賽），硫磺素T（thioflavin T，ThT）及其他常規(guī)化學(xué)分析試劑（美國Sigma）。

Thermomixer 恒溫振蕩儀（德國Eppendorf），透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM，日本Hitachi），圓二色譜（circular dichroism，CD）儀（日本Jasco），Genios Pro 型酶標(biāo)儀、多功能檢測酶標(biāo)儀（美國Tecan），生物安全柜（新加坡ESCO）。

1.2 淀粉樣纖維SEVI形成的檢測方法

1.2.1 硫磺素T染色法 在440 μmol/L多肽PAP248-286溶液或精液中加入不同活性水平的SOD（23、46、92 U/mL），于37 ℃，200×g 的恒溫振蕩器中孵育，于不同時間點分別取樣10 μL 加入96 孔黑板中，再加入硫磺素T 溶液190 μL/孔，立即在酶標(biāo)儀中檢測熒光強度（發(fā)射波長為485 nm，激發(fā)波長為440 nm）。

1.2.2 圓二色譜法 將含有不同活性水平SOD（23、46、92 U/mL）的440 μmol/L 多肽PAP248-286 溶液混勻，于37 ℃，200 ×g 的恒溫振蕩器中孵育，在4 h 和48 h 時取樣；使用圓二色譜儀檢測樣品，樣品按PAP248-286 濃度稀釋至66 μmol/L，比色皿的光路為1 mm，掃描波長范圍為190～280 nm，波長間隔1.0 nm，掃描速度24 nm/min，檢測3 次后取平均值，最終圖譜為樣品圖譜減去溶劑（PBS）的圖譜。

1.2.3 TEM 觀察 在440 μmol/L 多肽PAP248-286 溶 液中加入SOD（92 U/mL）混勻，于37 ℃，200×g的振蕩器中孵育，在4 h和48 h分別取樣；樣品按PAP248-286濃度稀釋至30 μmol/L，滴于銅網(wǎng)上，2 min 后用濾紙吸走多余的液體，然后用磷鎢酸溶液（3%，pH 7.0）染色2 min并用濾紙吸走多余液體，用超純水洗1次，待銅網(wǎng)自然干燥后，即可觀察淀粉樣纖維的形態(tài)。

1.3 病毒感染實驗

1.3.1 感染性克隆病毒的制備及滴度測定 將CCR5 受體嗜性克隆病毒質(zhì)粒與PEI 按1∶3 的比例（質(zhì)量與體積比）混勻后轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞，37 ℃轉(zhuǎn)染8 h 后更換新鮮的DMEM 完全培養(yǎng)基；48 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，于1 500 ×g 離心15 min，取上清液，即得到HIV-1 克隆病毒，于?80 ℃保存?zhèn)溆?。將病毒液按不同比例稀釋，分別加入TZM-bl 細(xì)胞中，48 h 后用熒光素酶檢測試劑盒檢測病毒滴度［10］。

1.3.2 病毒感染能力的測定 取含有不等量SOD（23、46、92 U/mL）的440 μmol/L 多肽PAP248-286 溶液，混勻，于37 ℃，200×g 的振蕩器中孵育，于0、2、4、8、12、24和48 h分別取樣凍存。將TZM-b1細(xì)胞接種于96孔板中（l×105/mL），37 ℃培養(yǎng)過夜；含有SOD 的PAP248-286 溶液樣品于700×g 室溫離心10 min，棄上清液，用空白培養(yǎng)基重懸樣品，病毒（12 ng/孔，以p24抗原計算）與樣品以1∶1的體積比混合均勻，室溫孵育5 min，將混合液加入細(xì)胞中，感染3 h后更換新鮮DMEM 培養(yǎng)基；48 h后，棄上清液，PBS清洗1次，使用熒光素酶檢測試劑盒檢測其化學(xué)發(fā)光值，計算病毒感染增強倍數(shù)［21-22］。

1.4 SOD滅活后的作用檢測

參考文獻(xiàn)［23-24］方法，采用水浴75 ℃加熱40 min滅活SOD，取等量的有活性和滅活的SOD（46 U/mL）加入440 μmol/L 多肽PAP248-286 溶液中，重復(fù)上述硫磺素T染色法、圓二色譜法、病毒感染實驗。

1.5 精液中SOD活性的測定

按總SOD 活性檢測試劑盒說明書操作，簡述步驟如下：配制WST-8/酶工作液和反應(yīng)啟動工作液，依次在96 孔板中加入待測樣品、SOD 檢測緩沖液、WST-8/酶工作液和反應(yīng)啟動液，用振板器混勻，于37 ℃放置30 min后，檢測溶液450 nm 處的吸光度值，按說明書計算精液中的SOD活性水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。定量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較符合方差齊性時采用LSD 法，方差不齊時采用Dunnett T3檢驗法。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOD對PAP248-286形成SEVI的影響

硫磺素T 染色法結(jié)果如圖1A 所示：未加入SOD 的PAP248-286溶液在2 h時熒光強度已明顯升高，且隨時間逐漸升高，在24 h 后接近穩(wěn)定，說明多肽PAP248-286 生成了淀粉樣纖維，并逐漸增加。在加入不等量的SOD 體系中，SOD 呈劑量依賴性地抑制SEVI 的形成，92 U/mL SOD在48 h內(nèi)幾乎完全抑制SEVI的形成。

肽鏈的二級結(jié)構(gòu)有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊等特定立體結(jié)構(gòu)，每種構(gòu)象在圓二色譜圖都有特定的吸收峰，根據(jù)吸收特征峰可判斷肽鏈的結(jié)構(gòu)。淀粉樣纖維SEVI主要是β-折疊結(jié)構(gòu)，在220 nm附近有負(fù)峰。圓二色譜檢測結(jié)果如圖1B所示：在4 h時，各PAP248-286溶液反應(yīng)體系在220 nm附近均無明顯負(fù)峰，表明前體肽均未產(chǎn)生大量β-折疊結(jié)構(gòu)，即沒有形成大量SEVI。在反應(yīng)48 h 后，未加入SOD 的PAP248-286 溶液在220 nm 附近有明顯的負(fù)峰，表明此時溶液中已形成含β-折疊結(jié)構(gòu)的SEVI；而在加入了SOD 的溶液中仍未出現(xiàn)明顯負(fù)峰，即沒有形成大量的SEVI。

為了直觀地觀察SOD 對PAP248-286 形成SEVI 的影響，使用TEM 觀察淀粉樣纖維的形態(tài)。如圖1C 所示，4 h 時，單純PAP248-286 樣品在TEM 下可觀察到少量成熟纖維，而含有SOD 的多肽PAP248-286 溶液中未觀察到明顯纖維；48 h 時，單純PAP248-286 溶液中已經(jīng)形成大團的淀粉樣纖維，幾乎占滿整個視野，而加入了SOD 的樣品仍未觀察到纖維。

2.2 SOD抑制精液中淀粉樣纖維的形成

為了進一步探究SOD 對人體精液中PAP248-286 纖維化的影響，將健康志愿者的精液與不同活性水平的SOD混勻，振蕩孵育，于2 h、8 h取樣，經(jīng)硫磺素T 染色后測熒光強度。如圖2 所示，單純精液振蕩8 h 后其熒光值略有所增加，表明有新的淀粉樣纖維生成。在加入不同活性水平SOD 的體系中，SOD 可抑制精液中淀粉樣纖維的形成。

圖2 SOD對精液中淀粉樣纖維形成的抑制作用Fig 2 Inhibitory effect of SOD on the assembly of amyloid fibrils in SE-F

2.3 SOD對SEVI促進HIV-1感染能力作用的影響

結(jié)果如圖3 所示，隨著不同PAP248-286 溶液體系孵育時間的延長，病毒的感染增強倍數(shù)均逐漸增大，提示SEVI 形成的量越多，對病毒感染能力的增強作用越強；而SOD可抑制SEVI對病毒感染能力的增強作用，且SOD活性越高，抑制作用越強。

圖3 SOD對SEVI促進HIV-1感染能力的抑制作用Fig 3 Inhibition of SOD on the ability of SEVI to promote HIV-1 infection

2.4 滅活的SOD對PAP248-286形成SEVI的影響

將PAP248-286 溶液分別與等量未滅活或滅活的SOD振蕩孵育，硫磺素T 染色后檢測結(jié)果如圖4A 所示，加入滅活SOD與未加入SOD的PAP248-286溶液的熒光強度變化趨勢基本一致，48 h 時熒光強度均高于加入未滅活SOD的反應(yīng)體系。

在4 h和48 h分別取樣，圓二色譜法檢測β-折疊結(jié)構(gòu)。結(jié)果（圖4B）顯示48 h時，未加入SOD 及加入滅活SOD的PAP248-286 溶液均在220 nm 附近出現(xiàn)明顯的負(fù)峰，而加入未滅活SOD 的PAP248-286 溶液未出現(xiàn)明顯的吸收峰。

圖4 滅活的SOD對淀粉樣纖維SEVI形成的作用Fig 4 Effect of inactivated SOD on the assembly of SEVI amyloid fibrils

2.5 滅活的SOD對SEVI促進HIV-1感染能力作用的影響

分別檢測加入等量滅活與未滅活的SOD 后，不同孵育時間點的PAP248-286 溶液對病毒感染能力的影響。結(jié)果如圖5 所示，加入滅活SOD 的PAP248-286 溶液促進病毒感染的能力較加入未滅活SOD 的有所增強（P<0.05）， 但 略 弱 于 未 加 入SOD 的PAP248-286 溶 液（P>0.05）。

圖5 滅活SOD對SEVI促進病毒感染能力的作用Fig 5 Effect of inactivated SOD on the ability of SEVI to promote HIV-1 infection

2.6 人體精液中的SOD活性

使用總SOD 活性檢測試劑盒檢測5 份健康志愿者精液中SOD 的活性水平，其值分別為74.87、68.69、85.46、113.29、109.53 U/mL。

3 討論

精液中的淀粉樣纖維SEVI 在HIV-1 性傳播過程中可顯著促進HIV-1 的感染［5］，使其在近年來備受關(guān)注。本研究通過硫磺素T 熒光染色法、圓二色光譜法、TEM 觀察及病毒感染增強實驗均證實SOD 可抑制前體肽PAP248-286 形成淀粉樣纖維SEVI，進而拮抗SEVI 對HIV-1感染能力的促進作用。SOD是人體內(nèi)廣泛存在的一種金屬蛋白酶，酶的活性直接影響其生理功能。我們的實驗結(jié)果表明，等量滅活的SOD 不能抑制PAP248-286 形成SEVI，不能有效拮抗SEVI促HIV-1 感染的能力，說明SOD 抑制SEVI形成很可能與其活性有關(guān)，但具體的內(nèi)在機制有待進一步探究。

已有多項體外實驗揭示了人體中天然存在一些保護因子，對HIV-1的性傳播具有一定的抑制作用；例如女性陰道中的陽離子多肽（defensins）［25］、乳酸［26］，女性陰道分泌液和男性精液中的外泌體［27-28］。近年來，本課題組研究了人體中潛在的通過SEVI 抑制HIV 性傳播的因素。之前的研究［12］發(fā)現(xiàn)女性陰道中的乳酸具有抑制PAP248-286形成SEVI的作用。而本研究揭示了男性精液中天然存在的SOD 也具有抑制PAP248-286 聚合形成SEVI的作用。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［5］的報道，正常人體精液中PAP248-286 的濃度為35 μg/mL；而本研究使用的PAP248-286 濃度為440 μmol/L，即2 mg/mL，遠(yuǎn)高于正常人體精液中的濃度。在SOD 抑制SEVI 形成的實驗中發(fā)現(xiàn)，SOD 活性達(dá)到46 U/mL或以上即可發(fā)揮作用；而檢測的5份健康志愿者精液中SOD的活性均大于該水平。其他文獻(xiàn)［15］結(jié)果也證實，健康男性精液中SOD 的活性約為100 U/mL。故健康人體精液中SOD 的活性可以有效抑制PAP248-286 形成SEVI。然而，據(jù)相關(guān)報道［15］稱，不同疾病狀態(tài)的男性的精液中SOD 活性有所不同，如抗精子抗體陽性的男性不育患者的精液中SOD 活性可降至33.54 U/mL，其抑制SEVI形成的能力可能減弱。另外，男性生殖器炎癥疾病、性傳播病原體共感染等均會對精液SOD 活性產(chǎn)生影響［29-31］，提示這部分患者可能是HIV 性傳播的高風(fēng)險人群，對HIV阻斷策略的設(shè)計及實施具有一定的指導(dǎo)意義。

因此，本研究的結(jié)果為預(yù)防HIV-1的性傳播提供了新的思路；同時也提示SOD 可能可以與其他抗病毒藥物聯(lián)合使用制成多效抗微生物劑，用于抑制HIV-1的性傳播。

參·考·文·獻(xiàn)

[1] Duesberg PH. AIDS epidemiology: inconsistencies with human immunodeficiency virus and with infectious disease[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88(4):1575-1579.

[2] Castellano LM, Shorter J. The surprising role of amyloid fibrils in HIV infection[J]. Biology(Basel),2012,1(1):58-80.

[3] Buvé A,Bishikwabo-Nsarhaza K,Mutangadura G. The spread and effect of HIV-1 infection in sub-Saharan Africa[J]. Lancet,2002,359(9322):2011-2017.

[4] Roan NR, Greene WC. A seminal finding for understanding HIV transmission[J]. Cell,2007,131(6):1044-1046.

[5] Münch J, Rücker E, St?ndker L, et al. Semen-derived amyloid fibrils drastically enhance HIV infection[J]. Cell,2007,131(6):1059-1071.

[6] Roan NR,Münch J,Arhel N,et al. The cationic properties of SEVI underlie its ability to enhance human immunodeficiency virus infection[J]. J Virol,2009,83(1):73-80.

[7] Li JQ,Yang ZC,Liu H, et al. ADS-J1 disaggregates semen-derived amyloid fibrils[J]. Biochem J,2019,476(6):1021-1035.

[8] Tan SY,Li JQ,Cheng HY,et al. The anti-parasitic drug suramin potently inhibits formation of seminal amyloid fibrils and their interaction with HIV-1[J]. J Biol Chem,2019,294(37):13740-13754.

[9] Xun TR,Li WJ,Chen JQ,et al. ADS-J1 inhibits semen-derived amyloid fibril formation and blocks fibril-mediated enhancement of HIV-1 infection[J].Antimicrob Agents Chemother,2015,59(9):5123-5134.

[10] Qiu MJ,Li ZF,Chen YL,et al. Tolcapone potently inhibits seminal amyloid fibrils formation and blocks entry of Ebola pseudoviruses[J]. Front Microbiol,2020,11:504.

[11] 藍(lán)燕, 楊梓超, 劉涵, 等. PSB0739 抑制精液來源的淀粉樣纖維形成[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2018,38(11):1338-1343.

[12] 李錦清,宋亞麗,尋添榮,等. 乳酸抑制精液來源淀粉樣纖維的形成[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2017,37(7):907-913.

[13] 于平. 超氧化物歧化酶研究進展[J]. 生物學(xué)通報,2006,41(1):4-6.

[14] 袁牧,王昌留,王一斐,等. 超氧化物歧化酶的研究進展[J]. 中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2016,25(6):550-558.

[15] Zhang HF, Zhao EY, Zhang CY, et al. The change of semen superoxide dismutase and acrosin activity in the sterility of male patients with positive antisperm antibody[J]. Cell Biochem Biophys,2015,73(2):451-453.

[16] Arisan ED, Arisan S, Kiremit MC, et al. Manganese superoxide dismutase polymorphism in chronic pelvic pain syndrome patients[J]. Prostate Cancer Prostatic Dis,2006,9(4):426-431.

[17] Eskiocak S,Gozen AS,Kilic AS,et al. Association between mental stress&some antioxidant enzymes of seminal plasma[J]. Indian J Med Res, 2005,122(6):491-496.

[18] Mostafa T, Anis TH, El-Nashar A, et al. Varicocelectomy reduces reactive oxygen species levels and increases antioxidant activity of seminal plasma from infertile men with varicocele[J]. Int J Androl,2001,24(5):261-265.

[19] Akyol O, Ozbek E, Uz E, et al. Malondialdehyde level and total superoxide dismutase activity in seminal fluid from patients with varicocele[J]. Clin Exp Med,2001,1(1):67-68.

[20] 毛靜,郭潤發(fā),朱文凱,等. 男性精漿超氧化物歧化酶活性與各項精子參數(shù)間的關(guān)系[J]. 海南醫(yī)學(xué),2019,30(4):451-454.

[21] 陳金拳. SEVI 淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)形成的影響因素及抑制劑的研究[D]. 廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2015.

[22] 李錦清. Suramin作為預(yù)防艾滋病多效殺微生物劑的研究[D]. 廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2017.

[23] 金生浩,吳梧桐. 肝素修飾人血超氧化物歧化酶穩(wěn)定性研究[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報,1994,25(6):373-375.

[24] 曾仲奎,張鵬飛,鮑錦庫,等. 牛血超氧化物歧化酶在變性因素影響下的酶活與構(gòu)象變化[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),1997,34(4):516-521.

[25] Cole AM, Cole AL. Antimicrobial polypeptides are key anti-HIV-1 effector molecules of cervicovaginal host defense[J]. Am J Reproductive Immunol,2008,59(1):27-34.

[26] Tyssen D,Wang YY,Hayward JA,et al. Anti-HIV-1 activity of lactic acid in human cervicovaginal fluid[J]. mSphere,2018,3(4):e00055-18.

[27] Madison MN, Roller RJ, Okeoma CM. Human semen contains exosomes with potent anti-HIV-1 activity[J]. Retrovirology,2014,11:102.

[28] Smith JA, Daniel R. Human vaginal fluid contains exosomes that have an inhibitory effect on an early step of the HIV-1 life cycle[J]. AIDS, 2016,30(17):2611-2616.

[29] Nada HA, El-Shabrawy MM, Ibrahim SH, et al. Measurement of serum glutathione peroxidase, catalase and superoxide dismutase concentration in patients with external anogenital warts before and after treatment with intralesional tuberculin purified protein derivative[J]. Andrologia, 2020,52(9):e13661.

[30] Quaye O, Kuleape JA, Bonney EY, et al. Imbalance of antioxidant enzymes activities and trace elements levels in Ghanaian HIV-infected patients[J].PLoS One,2019,14(7):e0220181.

[31] Strycharz-Dudziak M,Fo?tyn S,Dworzański J,et al. Glutathione peroxidase(GPx) and superoxide dismutase (SOD) in oropharyngeal cancer associated with EBV and HPV coinfection[J]. Viruses,2020,12(9):E1008.