趙 芬，晉巧巧，苑克勇，侯秀秀，黃正蔚#，馬 瑞，2#

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓科，國家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海200011；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院浦東分院，上海200125

脂代謝異常是指體內(nèi)脂質(zhì)合成、分解、消化、吸收、轉(zhuǎn)運等過程發(fā)生障礙，從而導(dǎo)致血液和其他組織中脂類物質(zhì)的質(zhì)或量異常，進而影響身體機能的情況［1］。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，在全球范圍內(nèi)，脂代謝異常的發(fā)病率逐年升高，現(xiàn)已成為危害人體健康的一大殺手［1］。血脂紊亂作為臨床上最常見的脂代謝異常狀態(tài)，是包括冠狀動脈粥樣硬化和中風(fēng)在內(nèi)的多種疾病的重要危險因素［2］，因此，對血脂紊亂的早期預(yù)警和個性化預(yù)防、診治等方面的探索具有重要的臨床意義。研究［3］表明以口腔菌群紊亂為主要致病因素的口腔感染性疾?。ㄈ缪乐苎椎龋┡c機體的血脂水平存在關(guān)聯(lián)，但口腔菌群微生物本身與宿主血脂水平的相關(guān)性鮮有研究。唾液因其具有流動性可與口腔內(nèi)各個細菌粘附位點（如舌、腭、扁桃體、齦上菌斑等）相接觸，故通常認為唾液菌群微生物的組成結(jié)構(gòu)可代表整個口腔微生態(tài)的基本情況［4］。此外，有文獻［5］報道個體的唾液菌群組成結(jié)構(gòu)可在相當(dāng)長的時間內(nèi)保持相對穩(wěn)定，加之唾液采集具有無需專業(yè)器械、技術(shù)敏感性低、無創(chuàng)等優(yōu)點［6］，現(xiàn)已廣泛用作口腔菌群采樣。目前，還未有關(guān)于唾液菌群微生物與宿主血脂水平相關(guān)性的報道，因此，本研究通過16S rDNA 測序和生物信息學(xué)分析技術(shù)探究唾液菌群微生物與血脂水平的關(guān)聯(lián)，以期為下一步挖掘唾液菌群微生物作為個體脂代謝異常的個性化預(yù)警指標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)后，在江西省南昌市進賢縣進行健康普查的人群中募集志愿者114 人（男性50 人，女性64人），入組者均在采樣前簽署紙質(zhì)版知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在45～60歲之間。②自述無器質(zhì)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①正在服用降脂藥物者。②6個月內(nèi)使用過抗生素持續(xù)5 d 或以上者。③患有感染性、傳染性疾病及內(nèi)分泌系統(tǒng)器質(zhì)性病變者。④良、惡性腫瘤患者。⑤免疫功能異?；颊?。⑥認知功能、行為能力障礙者。⑦患有各種原因?qū)е碌目谇荒撃[、口腔癌前病變及口腔癌等口腔疾病的患者。⑧長期大量吸煙者。

1.2 研究對象血脂水平的獲取

收集研究對象血脂水平的檢查結(jié)果，包括血清總膽固醇（total cholesterol，TCH）、三酰甘油（triacylglycerol，TAG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-Ch）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-Ch）。上述數(shù)據(jù)均經(jīng)志愿者知情同意后從健康普查數(shù)據(jù)庫中調(diào)取。

1.3 唾液菌群樣本采集及DNA抽提、擴增

唾液菌群樣本的采集按照以往文獻［7］中描述的方法在研究對象清晨進食前進行。采集到的唾液菌群樣本立即置于液氮罐中運輸、保存，直至DNA 抽提。按照QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，美國）說明書中的操作流程抽提唾液菌群樣本中的總DNA，隨后應(yīng)用NanoDrop 2000 UV-vis 分光光度計（Thermo Scientific，美國）檢測所得DNA 的濃度和純度，應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所得DNA 的完整性。對符合檢測標(biāo)準(zhǔn)的DNA 進行16S rDNA V3-V4 區(qū) 擴 增。 338F 引 物 序 列 為： 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；806R 引物序列為：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR 擴 增 使 用GeneAmp 9700 設(shè)備（ABI，美國）的thermocycler PCR系統(tǒng)進行操作，擴增條件為：95 ℃變性3 min，隨后進行包括95 ℃變性30 s，55℃退火30 s 及72 ℃延伸45 s 這3 個步驟在內(nèi)的27 個循環(huán)，最后于72 ℃條件下充分延伸10 min。將經(jīng)上述步驟擴增所得的產(chǎn)物置于?20 ℃中凍存。

1.4 Illumina MiSeq PE300測序

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences， 美 國） 純 化 后 按 照 試 劑 盒NEBNext?Ultra ? DNA Library Prep Kitfor Illumina?（New England Biolabs，美國）說明書中標(biāo)注的流程進行建庫操作，最后使用Illumina MiSeq PE300 測序平臺（Illumina，美國） 進行測序。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析及生物信息學(xué)分析

使用Graphpad Prism 6 軟件對研究對象的一般情況及血脂水平進行統(tǒng)計學(xué)分析。定量資料用±s表示，采用非配對t 檢驗進行分析；定性資料用n（%）表示，采用Yates連續(xù)性校正χ2檢驗進行分析。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

測序所得的原始數(shù)據(jù)（raw fastq）經(jīng)Trimmomatic 工具（https：//kbase.us/） 進 行 質(zhì) 控 后 使 用FLASH 軟 件（https：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/index.shtml）進行拼接，隨后按97%的序列相似性使用UPARSE軟件（http：//drive5. com/uparse/） 對 操 作 分 類 單 元（operational taxonomic units，OTUs）進行聚類分析，并對照SILVA數(shù)據(jù)庫（https：//www.arb-silva.de/）對所得OTUs 表進行物種注釋。最后，采用Spearman 相關(guān)分析挖掘唾液菌群微生物中豐度前50的屬與宿主血脂水平的相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的一般情況及血脂水平統(tǒng)計

114 名研究對象的一般情況及血脂水平統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 研究對象的一般情況及血脂水平Table 1 Demographic and clinical characteristics of the study participants

2.2 唾液菌群測序結(jié)果的物種注釋

唾液菌群樣本測序后共獲得4 683 576 條序列，平均每個樣本的序列數(shù)為（41 084±4 740）條。聚類所得的OTUs 數(shù)為1 153，對照SILVA 數(shù)據(jù)庫共注釋到23 個門、43個綱、89個目、147個科和317個屬。

2.3 唾液菌群微生物的物種組成分析

114個唾液菌群樣本的物種豐度聚類熱圖如圖1（門水平）和圖2（屬水平）所示，各個樣本的微生物組成結(jié)構(gòu)具有相似性，其中唾液菌群微生物門水平的優(yōu)勢物種為：Firmicutes、Bacteriodetes、Proteobacteria、Actinobateria、Fusobacteria 和Saccharibacteria；屬水平的優(yōu)勢物種為：Neisseria spp.、Streptococcus spp.、Porphyromonas spp.、Veillonella spp.、 Prevotella spp.、 Fusobacterium spp.、Capnocytophaga spp.、Leptotrichia spp.、Corynebacterium spp.和Actinomyces spp.。

圖1 門水平的物種豐度聚類熱圖Fig 1 Community heat map at phylum level

2.4 唾液菌群微生物與宿主血脂水平的關(guān)聯(lián)分析

Spearman 相關(guān)分析顯示在唾液菌群微生物豐度前50的屬中，Neisseria spp.的豐度與宿主血清TCH、TAG 和LDL-Ch 成負相關(guān)；Gemella spp.的豐度與宿主血清TCH、LDL-Ch 水平呈正相關(guān)；與宿主血清HDL-Ch 水平成負相關(guān)的屬有Comamonas spp.，F(xiàn)ilifactor spp.和Parvimonas spp.（圖3）。

3 討論

圖2 屬水平的物種豐度聚類熱圖Fig 2 Community heat map at genus level

隨著人類微生物組計劃（The Human Microbiome Project，HMP）第一階段和第二階段的順利完成［8］，人們對人體微生物的認識越來越深入。目前認為人體微生物可參與調(diào)節(jié)機體物質(zhì)代謝、促進營養(yǎng)吸收，調(diào)控免疫機能等生理過程，并與多種系統(tǒng)性和全身疾病的發(fā)生發(fā)展存在聯(lián)系［9］。口腔作為人體內(nèi)僅次于腸道的第二大菌庫，其菌群與阿爾茨海默癥、動脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝硬化、炎癥性腸病等多種疾病密切相關(guān)［10］。此外，亦有研究表明，口腔菌群與“人體第二基因組”腸道菌群存在千絲萬縷的聯(lián)系：Arimatsu 等［11］報道口服牙齦卟啉單胞菌可顯著改變腸道菌群中厚壁菌門與擬桿菌門的比率（Fimicutes/Bacteroidetes ratio，評估腸道菌群健康狀況的重要指標(biāo)）；Li 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，口腔菌群微生物可以克服物理和化學(xué)屏障，在無菌小鼠的腸道內(nèi)定植。以上證據(jù)表明口腔菌群可通過影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)來與機體的健康狀態(tài)發(fā)生聯(lián)系，而與腸道菌群相比，口腔菌群具有采樣更便捷、干預(yù)手段更直接等優(yōu)勢［13］，故開發(fā)口腔菌群來替代腸道菌群進行人體微生物與系統(tǒng)健康相關(guān)的研究前景廣闊。唾液為口腔菌群常見的采樣形式，其與糖尿病、代謝綜合征、肥胖等機體代謝疾病密切相關(guān)［14-16］，故在一定程度上可反映機體的代謝狀態(tài)，但唾液菌群微生物與宿主血脂水平的關(guān)聯(lián)尚未被證實。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)唾液菌群微生物與宿主血脂水平存在關(guān)聯(lián)，豐富了既往對唾液菌群與宿主代謝狀態(tài)之間聯(lián)系的認識，為唾液菌群微生物在脂代謝異常個體的早期預(yù)警和個性化精準(zhǔn)診療中的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

人體微生物的組成結(jié)構(gòu)可受遺傳基因、生活環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)等多種因素影響［17］，但某個部位的優(yōu)勢菌在人群中通常保持相對穩(wěn)定，這些在某個部位出現(xiàn)頻率和豐度均較高且隨著時間推移變化較小的物種被稱為這個部位的核心菌群［18］。有研究［14-16］報道，唾液的核心菌群在門水平主要為Firmicutes、Bacteriodetes、Proteobacteria、Actinobateria、Fusobacteria 和Saccharibacteria；在屬水平主要為Neisseria spp.、Streptococcus spp.、Porphyromonas spp.、Veillonella spp.、Prevotella spp.、Fusobacterium spp.、Capnocytophaga spp.、Leptotrichia spp.、Corynebacterium spp.、Actinomyces spp.。以上報道與本研究的結(jié)果相符（圖1～2）。這表明雖然唾液菌群微生物的組成結(jié)構(gòu)存在個體差異，但其核心菌群在人群中具有相對穩(wěn)定性，這種特異性及穩(wěn)定性賦予了唾液菌群微生物作為生物標(biāo)志物用于宿主血脂水平與脂代謝狀態(tài)研究的條件。

圖3 唾液菌群微生物中豐度前50的屬與宿主血脂水平的Spearman相關(guān)分析熱圖。Fig 3 Heatmap of Spearman correlation analysis between the top 50 abundant genera of salivary microbiome and the blood lipid levels of hosts

目前，血脂紊亂已成為困擾人們的一大健康問題。在常用的血脂監(jiān)測指標(biāo)中，血清TCH、TAG 和LDL-Ch異常升高通常意味著機體存在脂代謝紊亂的情況；而HDL-Ch可通過膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運、抗氧化、抗炎等機制實現(xiàn)抗動脈粥樣硬化作用，血清中HDL-Ch的含量與患心血管病的風(fēng)險成負相關(guān)［19］。在本研究中，唾液菌群Neisseria spp.的豐度與血清TCH、TAG 和LDL-Ch水平均成負相關(guān)，這表明唾液菌群中Neisseria spp.的豐度升高預(yù)示著相對健康的血脂狀態(tài)，這與以往研究［20-21］的結(jié)果相符：與牙周病、糖尿病等疾病狀態(tài)相比，Neisseria spp.的豐度在健康狀態(tài)下更高。Gemella spp.為革蘭陽性、兼性厭氧菌，一般認為其與感染性心內(nèi)膜炎有關(guān)［22］，亦有文獻［23-24］報道唾液菌群中Gemella spp.的豐度升高與口腔扁平苔蘚、炎癥性腸病等多種炎癥性、免疫性疾病狀態(tài)相關(guān)。在本研究中，Gemella spp.的豐度與宿主血清TCH、LDL-Ch 水平呈正相關(guān)，表明Gemella spp.可能為與血脂紊亂狀態(tài)相關(guān)的唾液菌群標(biāo)志物。與宿主血清HDL-Ch 水平成負相關(guān)的3 個屬（Comamonas spp.，F(xiàn)ilifactor spp.和Parvimonas spp.）在慢性牙周炎、結(jié)直腸癌等疾病狀態(tài)下的唾液菌群中亦表達上調(diào)［25-26］，提示這3個菌屬與機體的多種疾病狀態(tài)相關(guān)。以上結(jié)果表明，血脂紊亂狀態(tài)下，唾液菌群中與免疫性、炎癥性疾病相關(guān)的細菌豐度增高，而與健康狀態(tài)相關(guān)的細菌豐度降低。其中，Neisseria spp.和Gemella spp.與多個血脂指標(biāo)存在指向性一致的相關(guān)關(guān)系，因此，可進一步探究其作為宿主脂代謝紊亂相關(guān)生物標(biāo)志物的可行性。

本研究結(jié)果表明，在人群中唾液菌群微生物的構(gòu)成具有相對穩(wěn)定性且與宿主血脂水平存在關(guān)聯(lián)。在唾液菌群微生物豐度前50 的屬中，Neisseria spp.的豐度與宿主血清TCH、TAG 和LDL-Ch 水平成負相關(guān)；Gemella spp.的豐度與宿主血清TCH、LDL-Ch水平呈正相關(guān)；與宿主血清HDL-Ch 水平成負相關(guān)的屬有Comamonas spp.，F(xiàn)ilifactor spp.和Parvimonas spp.。因此，可進一步挖掘唾液菌群微生物作為生物標(biāo)志物用于脂代謝異常個體的早期預(yù)警和個性化精準(zhǔn)診療，但此生物標(biāo)志物的可靠性尚需在更大樣本量的人群和進一步的體內(nèi)外實驗中驗證。

參·考·文·獻

[1] Bjornstad P, Eckel RH. Pathogenesis of lipid disorders in insulin resistance:a brief review[J]. Curr Diab Rep,2018,18(12):127.

[2] Kopin L, Lowenstein C. Dyslipidemia[J]. Ann Intern Med,2017, 167(11):81-96.

[3] Jaramillo A, Lafaurie GI, Millán LV, et al. Association between periodontal disease and plasma levels of cholesterol and triglycerides[J]. Colomb Med(Cali),2013,44(2):80-86.

[4] Segata N, Haake SK, Mannon P, et al. Composition of the adult digestive tract bacterial microbiome based on seven mouth surfaces,tonsils,throat and stool samples[J]. Genome Biol,2012,13(6):R42.

[5] Wang J, Jia Z, Zhang B, et al. Tracing the accumulation of in vivo human oral microbiota elucidates microbial community dynamics at the gateway to the GI tract[J]. Gut,2020,69(7):1355-1356.

[6] Kodukula K, Faller DV, Harpp DN, et al. Gut microbiota and salivary diagnostics: the mouth is salivating to tell us something[J]. Biores Open Access,2017,6(1):123-132.

[7] Navazesh M. Methods for collecting saliva [J]. Ann N Y Acad Sci. 1993,694:72-77.

[8] Integrative HMP (iHMP) Research Network Consortium. The Integrative Human Microbiome Project[J]. Nature,2019,569(7758):641-648.

[9] Dominguez-Bello MG, Godoy-Vitorino F, Knight R, et al. Role of the microbiome in human development[J]. Gut,2019,68(6):1108-1114.

[10] Gao L,Xu T,Huang G,et al. Oral microbiomes:more and more importance in oral cavity and whole body[J]. Protein Cell,2018,9(5):488-500.

[11] Arimatsu K, Yamada H, Miyazawa H, et al. Oral pathobiont induces systemic inflammation and metabolic changes associated with alteration of gut microbiota[J]. Sci Rep,2014,4:4828.

[12] Li B, Ge Y, Cheng L, et al. Oral bacteria colonize and compete with gut microbiota in gnotobiotic mice[J]. Int J Oral Sci,2019,11(1):10.

[13] Zhang X,Zhang D,Jia H,et al. The oral and gut microbiomes are perturbed in rheumatoid arthritis and partly normalized after treatment[J]. Nat Med,2015,21(8):895-905.

[14] Sabharwal A,Ganley K,Miecznikowski JC,et al. The salivary microbiome of diabetic and non-diabetic adults with periodontal disease[J]. J Periodontol,2019,90(1):26-34.

[15] Troisi J, Belmonte F, Bisogno A, et al. Metabolomic salivary signature of pediatric obesity related liver disease and metabolic syndrome[J]. Nutrients,2019,11(2):274.

[16] 吳宇佳,遲曉培,陳峰,等. 肥胖者唾液微生物宏基因組學(xué)特點[J]. 北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2018,50(1):5-12.

[17] Zaura E, Keijser BJ, Huse SM, et al. Defining the healthy "core microbiome" of oral microbial communities[J]. BMC Microbiol, 2009,9:259.

[18] Hu YJ, Shao ZY,Wang Q, et al. Exploring the dynamic core microbiome of plaque microbiota during head-and-neck radiotherapy using pyrosequencing[J]. PLoS One,2013,8(2):e56343.

[19] Kalita S, Khandelwal S, Madan J, et al. Almonds and cardiovascular health:areview[J]. Nutrients,2018,10(4):468.

[20] Hintao J, Teanpaisan R, Chongsuvivatwong V, et al. The microbiological profiles of saliva, supragingival and subgingival plaque and dental caries in adults with and without type 2 diabetes mellitus[J]. Oral Microbiol Immunol,2007,22(3):175-181.

[21] Meuric V, Le Gall-David S, Boyer E, et al. Signature of microbial dysbiosis in periodontitis[J]. Appl Environ Microbiol,2017,83(14):e00462-17.

[22] Shinha T. Endocarditis due to Gemellamorbillorum[J]. Intern Med,2017,56(13):1751.

[23] Wang X,Zhao Z,Tang N,et al. Microbial community analysis of saliva and biopsies in patients with oral lichen planus[J]. Front Microbiol,2020,11:629.

[24] Rengarajan S, Vivio EE, Parkes M, et al. Dynamic immunoglobulin responses to gut bacteria during inflammatory bowel disease[J]. Gut Microbes,2020,11(3):405-420.

[25] Cao Y, Qiao M, Tian Z, et al. Comparative analyses of subgingival microbiome in chronic periodontitis patients with and without IgA nephropathy by high throughput 16S rRNA sequencing[J]. Cell PhysiolBiochem,2018,47(2):774-783.

[26] Kwong TNY, Wang X, Nakatsu G, et al. Association between bacteremia from specific microbes and subsequent diagnosis of colorectal cancer[J].Gastroenterology,2018,155(2):383-390.e8.