羅嘉強，趙亮宇，姚晨成，朱子玨，邢曉宇，李 朋，田汝輝，陳慧興，孫 杰，李 錚

1.上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科中心男科，輔助生殖醫(yī)學科，上海200080；2.上海交通大學泌尿外科研究所男性健康評估中心，上海市生殖醫(yī)學重點實驗室，上海200080；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心泌尿外科，上海200127

2019 年12 月以來，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）導致的肺炎疫情在全球不斷蔓延［1-2］。據(jù)世界衛(wèi)生組織官方網(wǎng)站（https：//covid19.who.int/）數(shù)據(jù)顯示，截至2021年3月23日，新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）全球累計確診超12 341 萬例，已成為全人類面對的共同嚴峻挑戰(zhàn)。研究［3］證明，SARS-CoV-2通過與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2 （angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受體結(jié)合進入靶細胞。此外，同SARSCoV不同，SARS-CoV-2的S蛋白在S1/S2亞基具有獨特的弗林蛋白酶（furin）切割位點，S 蛋白在此位點的切割對于其介導的細胞融合及侵入人肺細胞至關(guān)重要［4-6］。

COVID-19 患者尸檢結(jié)果［7］顯示，SARS-CoV-2 感染會導致多處器官和組織損傷，并伴有明顯且廣泛的肺部病變；免疫組織化學（免疫組化）染色顯示，表達ACE2的一些氣管和支氣管黏膜上皮細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞和浸潤巨噬細胞的SARS-CoV-2蛋白呈陽性；通過基于實時定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）的病毒核酸檢測、免疫組化染色和透射電子顯微鏡，在睪丸中檢測到SARS-CoV-2 的RNA 和病毒顆粒。然而，SARS-CoV-2感染睪丸組織的途徑尚不明確［8］。對此，我們基于團隊前期睪丸單細胞RNA 測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-Seq）數(shù)據(jù)，繪制了生長發(fā)育各標志性年齡階段的生精正常的人及小鼠睪丸中ACE2和成人睪丸中FURIN的表達譜，以期為之后從動物水平研究SARS-CoV-2感染睪丸的途徑及其對睪丸功能產(chǎn)生的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織來源和主要試劑

1.1.1 組織來源

（1） 人體睪丸組織 2018 年11 月—2019 年2 月于上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院和上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心收集了10 例患者的少量手術(shù)剩余睪丸組織，包括行顯微鏡下睪丸取精術(shù)的26～33歲梗阻性無精子癥（obstructive azoospermia，OA）患者5 例；2 歲、5 歲、11 歲畸胎瘤切緣患者各1 例；8 歲滑動性睪丸對側(cè)活檢患者、17 歲睪丸扭轉(zhuǎn)對側(cè)活檢患者各1 例。本研究經(jīng)上述2 家醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均簽署《手術(shù)知情同意書》和《手術(shù)剩余組織用于科學研究知情同意書》，未成年患者由其監(jiān)護人代為簽署。

（2） 小鼠睪丸組織 小鼠睪丸組織取自出生后3、6、8、11、14、17、21、25 d 和5 周的C57BL/6 小鼠。處死小鼠后取出睪丸，用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗，剝?nèi)グ啄そM織，取黃豆大小睪丸組織作下一步處理。

本研究所用睪丸組織均為新鮮的未經(jīng)液氮凍存過的組織，并在睪丸離體后6 h 內(nèi)完成測序上機，以保證最大程度獲取到可靠的轉(zhuǎn)錄組信息。

1.1.2 實驗主要試劑 透明質(zhì)酸酶（Hyaluronldase，Sigma公司，貨號H3506）；胰酶（Typsin，Sigma 公司，貨號T8003）；Ⅳ型膠原酶（Collagenase Type Ⅳ，Gibco，貨號17104-019）；去死細胞試劑盒（Miltenyi，貨號130-090-482）。

1.2 研究方法

1.2.1 睪丸單細胞懸液的獲取 PBS 緩沖液沖洗睪丸組織3次后，用無菌剪刀剪碎，消化酶（Ⅳ型膠原酶，胰酶和透明質(zhì)酸酶）于37 ℃水浴消化15～20 min，直至完全消化后獲得細胞懸液。使用40 μm尼龍網(wǎng)過濾后離心，再重懸于含0.1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBS中。使用去死細胞試劑盒去除死細胞，用0.1%BSA的PBS洗滌1遍后進行計數(shù)并稀釋到5×105/mL濃度。

1.2.2 scRNA-Seq 文庫的建立和數(shù)據(jù)分析 用Chromium Single cell 3′Reagent（v3，10×GenomicsTM）試劑盒，將睪丸單細胞懸液加載到10×GenomicsTM微流控芯片上，分離并捕獲生成單細胞凝膠珠狀液。經(jīng)53 ℃逆轉(zhuǎn)錄45 min后，85℃5 min 終止反應(yīng)生成cDNA。然后用PCR 擴增cDNA，并將擴增的cDNA 進行片段化、末端修復、poly-A 尾添加、接頭連接并進行文庫擴增。用Illumina NovaSeq 6000 測序平臺進行測序。原始數(shù)據(jù)用Cell Ranger 軟件（V2.2.0，10×GenomicsTM）進行比對后得到細胞UMI 表達矩陣（數(shù)據(jù)上傳至GSE149512［9］），并和GEO 數(shù) 據(jù) 庫GSE124263［10］（2 個0 歲 樣 本 數(shù) 據(jù)） 和GSE134144［11］（7 歲和13 歲樣本數(shù)據(jù)各1 個）整合。通過如下標準進行細胞質(zhì)量篩選：①總UMI 大于500 且小于90 000。②總基因表達數(shù)大于500。③線粒體基因表達占比小于25%。剩余細胞采用R 包Seurat（V3.0.1）進行主成分分析（principal component analysis，PCA）［12］后，選擇PCs 1-20 執(zhí)行t-SNE（t-distributed stochastic neighbor embedding）降維分析和非監(jiān)督聚類從而獲得9個細胞群。

1.2.3 基因表達分析 采用已知的睪丸各類細胞標志物鑒定各群細胞。使用R 包Seurat （V3.0.1） 內(nèi)置命令VLNPLOT和FEATUREPLOT繪制小提琴圖和細胞分布點圖。檢索人類蛋白表達數(shù)據(jù)庫Human Protein Atlas（https：//www.proteinatlas.org），獲得ACE2（CAB026174）與FURIN（CAB009499）在成年男性睪丸組織中的免疫組化染色情況，染色樣本分別來自于29 歲和26 歲的男性。

基因表達的特異性統(tǒng)計分析采用Wilcoxon秩和檢驗。檢驗時，每個細胞被看作獨立樣本，按照細胞類型進行分組，比對特定類型的細胞群和其余睪丸細胞。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 睪丸各群細胞的鑒定

經(jīng)過質(zhì)量篩選，超過6萬個睪丸細胞的測序結(jié)果被保留。根據(jù)已知人睪丸各類細胞標志物，我們共鑒定出9個主要的細胞群，包括3群生殖細胞（精原細胞、精母細胞和精子細胞/精子）以及6群體細胞（Sertoli細胞、巨噬細胞、血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、Leydig 細胞和管周肌樣細胞）（圖1A）。經(jīng)鑒定，人睪丸各群細胞具有獨特的轉(zhuǎn)錄特征（圖1C）。用相同方法對5 周齡C57BL/6 小鼠睪丸scRNA-Seq結(jié)果進行分析，相應(yīng)地鑒定出9個主要的細胞群（圖1B、D）。

圖1 人和小鼠睪丸細胞的scRNA-Seq分析Fig 1 scRNA-Seq analysis of human and mouse testicular cells

2.2 人睪丸ACE2與FURIN的表達特征

成人睪丸scRNA-Seq 數(shù)據(jù)表明：ACE2 主要富集在Sertoli 細胞中，在Leydig 細胞、管周肌樣細胞和各級生精細胞中也均有明顯表達，而在其他類型的細胞中表達水平較低（圖2A、C）。ACE2 陽性的Sertoli 細胞占全部Sertoli 細胞的12.7%。人睪丸組織免疫組化染色顯示，ACE2 主要表達于Sertoli 細胞和Leydig 細胞（圖2E）。將本研究scRNA-Seq 數(shù)據(jù)與猶他大學醫(yī)學院的Guo 等［11］及加利福尼亞大學的Sohni 等［10］的數(shù)據(jù)整合后分析發(fā)現(xiàn)，ACE2 在Sertoli 細胞中的高表達模式同樣存在于其他年齡段，且Sertoli 細胞的ACE2 轉(zhuǎn)錄豐度隨著睪丸的發(fā)育而增加，青春期后成熟的Sertoli 細胞中ACE2 表達明顯高于幼兒期和兒童期（P=0.000，圖2D）。此外，對成人睪丸中FURIN 的表達特征進行分析發(fā)現(xiàn)：FURIN 在睪丸各群細胞中均有表達，在Sertoli 細胞和Leydig 細胞中表達量較高（圖2B、C）。免疫組化染色顯示，F(xiàn)URIN 表達于支持細胞和間質(zhì)中（圖2F）。綜上所述，人ACE2 主要表達于Sertoli 細胞和Leydig 細胞，尤其高表達于青春期后成熟的Sertoli 細胞中；FURIN 在人睪丸各群細胞中均有表達。

圖2 ACE2和FURIN在人睪丸中的表達模式Fig 2 Expression patterns of ACE2 and FURIN in human testicles

2.3 小鼠睪丸Ace2表達特征

動物實驗中通常使用小鼠作為模式動物對人類疾病進行初步研究，人鼠差異會影響疾病再現(xiàn)與研究可靠性。5 周齡成年C57BL/6 小鼠睪丸scRNA-Seq 數(shù)據(jù)表明，成年小鼠睪丸中Ace2 整體轉(zhuǎn)錄水平較低，且主要表達于血管平滑肌細胞（P=0.000），在Sertoli細胞中表達量很低（圖3A、B）。此外，我們對從出生后3 d 到5 周的小鼠睪丸scRNA-Seq 數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)：在小鼠睪丸發(fā)育的不同階段中，Ace2 轉(zhuǎn)錄本表達陽性的Sertoli 細胞數(shù)量極少且表達水平不高（圖3C），但血管平滑肌細胞中有較高的Ace2表達水平（圖3D）。

圖3 Ace2在小鼠睪丸中的表達模式Fig 3 Expression patterns of Ace2 in mouse testicles

3 討論

精子發(fā)生是精原干細胞自我更新和分化為成熟精子的過程［13］。Sertoli細胞作為生精小管腔內(nèi)唯一的體細胞，與包括精原細胞在內(nèi)的多級生精細胞直接接觸，并通過調(diào)控多種旁分泌和自分泌信號維持精子發(fā)生［14］。同時，Sertoli 細胞之間的緊密連接也是血睪屏障的關(guān)鍵組成部分，參與維持睪丸免疫豁免微環(huán)境。Leydig 細胞位于睪丸間質(zhì)，是合成和分泌雄激素的主要細胞［15］。

多種病毒感染可引起睪丸炎［16］，其中腮腺炎病毒（mumps virus，MuV）是常見的病原體之一。14%～35%青春期后的男性感染腮腺炎會并發(fā)睪丸炎，甚至造成生育力受損［17］，但至今機制未明。有學者［18］基于小鼠研究發(fā)現(xiàn)，MuV 感染Sertoli 細胞并刺激其產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），通過自身炎癥反應(yīng)上調(diào)趨化因子CXCL10（C-X-C motif chemokine ligand 10）表達，進而誘導生精細胞凋亡。此外，MuV 感染會損傷Leydig 細胞功能，影響睪酮的正常分泌［19］。SARSCoV 感染引起睪丸炎也有報道［20-21］。遲曉春等［21］對6 例因患嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）死亡的患者進行尸檢發(fā)現(xiàn)，其睪丸組織均表現(xiàn)出睪丸炎的病理改變：睪丸間質(zhì)充血并有白細胞浸潤、生精小管基膜增厚、各級生精細胞明顯減少、管腔內(nèi)幾乎未見精子。此外，他們還在生精上皮內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的自身抗體IgG 和IgA，推測SARS-CoV 所引起的自身免疫性損傷可能是導致睪丸炎的主要原因之一。

ACE2 在人睪丸組織中廣泛表達，尤其高表達于Sertoli細胞和Leydig細胞，表明人睪丸中存在大量SARSCoV-2 結(jié)合位點?，F(xiàn)有研究［5-6］認為，F(xiàn)URIN 對SARSCoV-2 的S 蛋白的預激活是病毒感染細胞的關(guān)鍵，而FURIN 表達于包括人支持細胞和間質(zhì)細胞在內(nèi)的多群人類睪丸細胞中。因此，綜合本研究結(jié)果和已有數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，我們推測人睪丸是SARS-CoV-2 的易感靶器官之一，病毒主要通過侵入Sertoli 細胞感染睪丸。ACE2 在人青春期后Sertoli 細胞中表達豐度相對更高，提示SARS-CoV-2對青春期后睪丸感染風險可能相對更大。SARS-CoV-2 可能通過破壞Sertoli 細胞和Leydig 細胞正常功能，引發(fā)炎性細胞因子異常表達，破壞正常血睪屏障和睪丸免疫豁免微環(huán)境，誘導生精細胞凋亡，導致男性生育力受損和睪丸內(nèi)分泌功能異常。

此外，盡管人和小鼠ACE2蛋白的氨基酸序列比對的一致性達到了82%，但是C57BL/6 小鼠睪丸中Ace2 的整體轉(zhuǎn)錄水平較低，且其在睪丸中表達分布與人具有顯著差異。這些結(jié)果提示，常規(guī)C57BL/6 小鼠模型不適用于模擬SARS-CoV-2感染對人類睪丸功能影響，需建立人源性hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠用于相關(guān)機制研究。此外，本研究尚存在一些不足之處，如同一年齡的重復不夠，所選擇的小鼠品系較為單一，只獲得了相關(guān)基因在人和小鼠睪丸不同發(fā)育時期的表達譜。未來需要增加重復、擴大小鼠品系的選擇范圍和完善細胞、動物水平上的機制研究。

綜上所述，本研究提供了SARS-CoV-2可能主要通過Sertoli細胞感染人類睪丸的生物信息學證據(jù)，結(jié)果提示了常規(guī)C57BL/6小鼠模型不適用于模擬SARS-CoV-2感染對人類睪丸功能影響。

參·考·文·獻

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