陳晨，任遠(yuǎn)，郭妮，鄭月，李育中，唐聰，譚銀珍，李嬌春，王學(xué)付，寸韡，畢研偉

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650031；

2.保山中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，云南保山678000

腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm）是引起流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）的病原菌［1］。該病多發(fā)于兒童，人群隱性感染多，發(fā)病率、病死率均較高。Nm可分為13個血清群，能引起侵襲性流腦的菌株多具有完整的莢膜結(jié)構(gòu)，包括A、B、C、Y、W135和X群［2］。無癥狀帶菌者是該病的主要傳染源，健康人群帶菌情況與流腦疫情趨勢呈現(xiàn)一定的相關(guān)性［3］。

保山市位于云南省西南部，處于滇西居中，是中國通往南亞、東南亞乃至歐洲各國的必經(jīng)之地，其西北、正南部與緬甸交界，而緬甸等部分東南亞國家尚未將流腦疫苗列為國家常規(guī)接種疫苗，隨著邊境地區(qū)人員遷徙與流動，時有從緬甸輸入流腦病例的報道［4］。保山市近年來腦膜炎奈瑟菌流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)缺乏，因此，本研究選擇保山市作為調(diào)查區(qū)域。

青年人群由于升學(xué)更易出現(xiàn)來自不同地區(qū)人員的學(xué)校聚集，這使得青年人群成為流腦暴發(fā)高危人群，而在中國，流腦疫苗主要針對的接種對象為嬰幼兒及3歲或6歲兒童，本研究選擇在18～22歲健康人群中調(diào)查腦膜炎奈瑟菌攜帶狀況，可為中國青年人接種流腦疫苗提供參考，為今后流腦疫情監(jiān)測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 本次調(diào)查選擇保山市隆陽區(qū)一高校作為調(diào)查點，采用隨機(jī)抽樣的方法，于2020年12月隨機(jī)抽取1 076名18～22歲且處于健康狀態(tài)的學(xué)生采集咽拭子樣本，共采集樣本1 076份。

1.2 參考菌株Nm標(biāo)準(zhǔn)菌株共5株，分別為A、B、C、W135、Y群，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所保存。

1.3 主要試劑 巧克力雙抗平板（含3.3μg／mL鹽酸萬古霉素和4.2μg／mL硫酸多黏菌素）培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司（貨號：J0612Y）；Taq DNA聚合酶等購自康為世紀(jì)生物科技有限公司（貨號：CW0655M）。

1.4 采樣及培養(yǎng) 受試者簽署知情同意書后采集咽拭子標(biāo)本，立即接種于巧克力雙抗平板，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24～48 h。

1.5 分離鑒定 挑取圓形，光滑，濕潤，中央凸起，邊界清晰，無色或灰色，不透明的菌落，轉(zhuǎn)接于新的巧克力雙抗平板，再次培養(yǎng)24 h，同時將標(biāo)準(zhǔn)菌株（B群）平板劃線，在相同條件下培養(yǎng)作為陽性對照；挑取菌落，溶解至1 mL PBS（pH 7.4）中，制備為菌懸液，取少量菌懸液，滴加至載玻片上進(jìn)行革蘭染色，取B群標(biāo)準(zhǔn)菌株平板上菌落作為陽性對照，雙球形的菌株進(jìn)行PCR鑒定和分群。

1.6 PCR鑒定和分群 挑取單菌落為模板進(jìn)行PCR檢測。首先對流腦通用基因莢膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因（crgA）和銅-鋅超氧化物歧化酶基因（sodC）進(jìn)行擴(kuò)增，確定為Nm陽性菌落；再對各血清群特異性基因進(jìn)行擴(kuò)增，以確定血清群。擴(kuò)增體系為：2×taq DNA聚合酶預(yù)混液5μL，引物（10μmol／L）各0.2μL，模板0.2μL，無菌水加至10μL。以標(biāo)準(zhǔn)菌株（B群）的crgA和sodC基因作為陽性對照，無菌水作為陰性對照。反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，共29個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列、靶基因及擴(kuò)增片段長度見表1［5］。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Excel軟件對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入整理，計算帶菌率，分析各血清群分布情況。

表1 引物序列、靶基因及擴(kuò)增片段長度Tab.1 Primer sequence，target gene and lengths of amplified fragments

2 結(jié)果

2.1Nm菌株的分離鑒定 咽拭子樣本接種于巧克力雙抗平板后培養(yǎng)24～48 h，Nm陽性菌株可生長為濕潤，略帶灰色半透明的圓形菌落，見圖1。挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，可鑒定為紅色，雙球形的革蘭陰性菌，見圖2。

圖1 咽拭子樣本涂板后培養(yǎng)24 hFig.1 Pharyngeal swab samples spread and cultured for 24 h

圖2 細(xì)菌培養(yǎng)后經(jīng)革蘭染色鏡檢（×100）Fig.2 Microscopy of bacterial culture after Gram staining（×100）

2.2 血清學(xué)分群PCR檢測結(jié)果顯示，Nm陽性菌株可見crgA和sodC基因條帶，見圖3。陽性菌株經(jīng)血清學(xué)分群，A群可見400 bp的orf-2基因條帶，B群可見180 bp的synD基因條帶，C、Y、W135群分別可見250、120和120 bp的siaD基因條帶，X群可見120 bp的ctrA基因條帶，見圖4。

2.3 調(diào)查結(jié)果1 076份咽拭子樣本中，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)和PCR檢測共鑒定出Nm陽性樣本17份，帶菌率為1.58%，其中B群菌株14份，C群菌株2份，X群菌株1份。

圖3 Nm crgA（A）和sodC（B）基因的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretic profile of PCR products of Nm crgA（A）and sodC（B）genes

圖4 Nm特異性分群基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretic profile of PCR products of Nm specific clustering genes

3 討論

Nm所導(dǎo)致的流腦是一種急性的呼吸道感染疾病，臨床診斷通常以出現(xiàn)發(fā)熱、嘔吐、頭痛為依據(jù)，該病多發(fā)于兒童，起病急，人群隱性感染多，發(fā)病率和病死率均較高。對于健康人群流腦的攜帶情況進(jìn)行調(diào)查，可有效監(jiān)測流腦的流行趨勢，及時采取措施，有效預(yù)防流腦疫情發(fā)生。目前對流腦的實驗室檢測方法較多，包括細(xì)菌分離培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測、普通PCR檢測、Real-time PCR檢測等。PCR是一種較常用的檢測方法，具有靈敏度較高，檢測快速，準(zhǔn)確的優(yōu)點，前期通過對于實驗方法的探索，證實PCR法對于流腦檢出的靈敏度可達(dá)1 copy／mL。其中細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法雖繁瑣且耗時長，咽拭子標(biāo)本若不及時涂板，易導(dǎo)致標(biāo)本失效，但這種方法可通過平板擴(kuò)增，使菌種得以保留，為后續(xù)流腦疫苗的進(jìn)一步研究提供材料。由于正常人群口腔中有葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌等幾百種細(xì)菌類型，咽拭子接種于抗性巧克力平板，平板上生長的菌群類型相較于無抗性的平板更單一，更有利于篩選出Nm，因此，本研究采用了含雙抗的巧克力平板，提高了檢出概率。同時，聯(lián)合PCR法準(zhǔn)確確定了樣本中攜帶的Nm的血清型。crgA和sodC基因是Nm保守的調(diào)控基因，可用于陽性菌株的鑒別，但不能用于血清學(xué)分群。編碼唾液酸轉(zhuǎn)移酶的siaD基因?qū)τ诓煌迦旱腘m具有特異性，因此可用于NmB、C、Y、W135等血清群的分群，A群Nm的莢膜多糖不是唾液酸，因此對于A群Nm莢膜表達(dá)基因的第2個ORF序列進(jìn)行擴(kuò)增，可特異性地檢出A群Nm。

中國曾在1959、1967、1977和1985年發(fā)生了4次流腦大流行［2］，1980年以來，A群流腦多糖疫苗開始在我國接種，使得流腦暴發(fā)率顯著降低，自2008年《擴(kuò)大免疫規(guī)劃實施方案》實施，流腦疫苗作為免費一類疫苗，接種人群大幅增加，但2008年以前出生的人群大多無流腦疫苗免疫史，有必要對這類人群進(jìn)行流腦帶菌率調(diào)查，有效預(yù)測流腦傳播和暴發(fā)趨勢。本次調(diào)查結(jié)果顯示，保山市18～22歲健康人群中Nm攜帶率為1.58%，與新疆等中國其他地區(qū)報道的調(diào)查數(shù)據(jù)相比［6］，保山市健康青年人群Nm攜帶率處于較低水平。

中國歷史上流行的流腦菌株以A群為主［6］，由于A群和A+C群Nm疫苗的廣泛使用，A、C群流腦病例呈持續(xù)下降趨勢，由于B群流腦疫苗尚未廣泛接種，目前中國流腦血清群分布以B群為主［7］。云南省近年來在健康人群中發(fā)現(xiàn)的Nm菌群有A、B、C群，人群抗體水平不高，對流腦的免疫力較弱［8］。在本次調(diào)查中，B群在Nm陽性樣本中所占比例最高，C群次之，未發(fā)現(xiàn)A群Nm陽性樣本，這與文獻(xiàn)報道一致［7］。另外，本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)1例X群陽性樣本，這是首次在云南省健康人群中分離出X群流腦菌株。X群Nm自20世紀(jì)90年代以來在非洲流行［9-10］，中國少有X群Nm的報道［11］，此次分離出X群陽性菌株，表明X群Nm在中國西南地區(qū)已出現(xiàn)，因此，關(guān)注流腦菌群變遷，加強(qiáng)監(jiān)測，及按計劃接種流腦疫苗仍今后流腦防控工作的關(guān)鍵。