屈蓉，吳康，吳娟，范小勇，呂建新

1.溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院、生命科學學院，浙江 溫州325035；

2.上海市（復(fù)旦大學附屬）公共衛(wèi)生臨床中心，上海201508

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的以呼吸系統(tǒng)受累為主的傳染病。2018年，全球新增約1 000萬TB病例，其中約145萬患者死亡，TB是全球單一感染病原菌所致疾病中致死人數(shù)最多的疾?。?］。因此，早期且快速診斷和及時有效治療是消除傳染源、控制TB的關(guān)鍵。

目前，TB診斷的主要方法有胸部X線檢查、細菌學檢測（痰涂片抗酸染色和細菌學培養(yǎng)法）、PPD皮膚試驗（tuberculin skin test，TST）及核酸擴增分子生物學檢測等綜合方法。細菌培養(yǎng)是TB診斷的金標準，但檢測周期長，僅靠其判斷會影響患者的及時治療［2］。PPD皮試是一種臨床常用的免疫學皮試檢測方法，操作簡單、耗時短，但無法明確區(qū)分卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）免疫、環(huán)境NTM（nontuberculosis mycobacteria）感染和致病性Mtb感染，鑒別診斷價值不高，且影響因素較多，易出現(xiàn)較高的假陽性和假陰性結(jié)果［3］。以Gene-Xpert為代表的核酸擴增技術(shù)在早期診斷中發(fā)揮日益重要的作用，正成為TB病原學診斷方法的一種重要補充，但其成本和對檢測環(huán)境的嚴格要求限制了其在基層醫(yī)院的廣泛使用［4］。因此，尋找靈敏度和特異性俱佳的Mtb抗原并將其運用至血清學檢測，仍是TB早期檢測及其鑒別診斷的一個重要手段。

MPT64存在于Mtb活躍復(fù)制的細菌細胞中，在培養(yǎng)初期大量分泌，隨著培養(yǎng)時間的延長而減少［5］。MPT64不存在于弱毒性的BCG菌株中，提示其可能是Mtb毒力相關(guān)因子。MPT64參與機體與免疫系統(tǒng)的相互作用［6-7］，可誘導抗原特異性T細胞免疫反應(yīng)，有可能作為診斷活動性結(jié)核的標志物［8］。本研究原核表達、純化了重組MPT64蛋白，并初步探討了其在TB血清學診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及蛋白 大腸埃希菌克隆菌株Top10及表達菌株BL21（DE3）、原核表達載體pET28a（+）、Mtb標準株H37Rv基因組、重組GroES蛋白、重組Ag85A蛋白均由上海市公共衛(wèi)生臨床中心結(jié)核病感染與免疫課題組保存。

1.2 血清樣本44份患者血清由上海市公共衛(wèi)生臨床中心于2020年1—8月收集，均為經(jīng)臨床表現(xiàn)及X線檢查或細菌學檢查、病理組織學檢查等確診為TB的病例，設(shè)為TB組。健康對照組［HC（healthy control）組］血清收集自該中心的36名體檢健康人群，均無TB密切接觸史，無臨床癥狀，胸片檢查無異常表現(xiàn)。

1.3 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶、Pfu DNA Polymerase和低相對分子質(zhì)量蛋白標準均購自立陶宛MBI Fermentas公司；HRP標記的鼠抗人IgA和HRP標記的山羊抗兔IgG為北京博奧龍生物技術(shù)公司產(chǎn)品；HRP標記的山羊抗人IgG抗體為美國BETHYL公司產(chǎn)品；親和層析所用介質(zhì)Ni-NTA Sepharose（Ni2+-NTA親和柱）為美國GE Healthcare公司產(chǎn)品；Protein G柱購自中科森輝微球技術(shù)（蘇州）有限公司。

1.4 實驗動物SPF級新西蘭大白兔，雌性，8周齡，體重2 kg，購自上海甲干生物技術(shù)有限責任公司，動物合格證號為：20150005004191。

1.5mpt64基因的擴增 根據(jù)GenBank中登錄的mpt64基因序列（AY208674）設(shè)計引物，上游引物F：5′-CGCGGATCCATGCGCCCAAGACCTACTGCGAG-3′（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點），下游引物R：5′-CCGGAATTCCTAGGCCAGCATCGAGTCGA-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點），擴增片段大小為687 bp。以H37Rv基因組DNA為模板，PCR擴增mpt64基因。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性1 min；98℃15 s，58℃15 s，68℃30 s，共30個循環(huán)；68℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切擴增產(chǎn)物及pET28a（+）質(zhì)粒，膠回收酶切產(chǎn)物，載體與mpt64基因片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細胞，挑選陽性單克隆，抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切（BamHⅠ／EcoRⅠ）鑒定正確后，送蘇州金唯智生物科技有限公司測序，鑒定正確質(zhì)粒命名為pET28a-mpt64。

1.7 重組MPT64蛋白的誘導表達 將重組表達質(zhì)粒pET28a-mpt64轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），挑取陽性單克隆接種于含50μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；再以2%比例轉(zhuǎn)種至200 mL LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至A600約0.6～0.8時，加入終濃度為1.0 mmol／L的IPTG，37℃誘導過夜；8 000×g離心10 min，收獲菌體，PBS重懸，超聲碎菌，收集全菌裂解液、離心后的上清和沉淀，進行12%SDS-PAGE分析。

1.8 重組MPT64蛋白的純化 將重組菌大量培養(yǎng)、誘導表達并超聲破碎，離心后收集上清，經(jīng)Ni2+-NTA親和柱純化。用不同咪唑濃度（25、50、100、150、250和500 mmol／L）的洗脫液（含50 mmol／L Tris-HCl，100 mmol／L NaCl）逐步洗脫，收集洗脫液，12%SDS-PAGE分析。收集純度較高的幾管洗脫液，透析除去鹽類及咪唑，BCA測定濃度，1 mL／管分裝保存。

1.9 MPT64兔多克隆抗血清的制備 將純化的MPT64蛋白600μg與弗氏完全佐劑1∶1混合，皮下多點免疫新西蘭大白兔，隔周免疫1次，共4次。第2、4、6周與弗氏不完全佐劑1∶1混合加強免疫，2周后，耳緣靜脈采血，分離血清，-80℃保存。間接ELISA法檢測效價：用2μg／mL MPT64蛋白包被ELISA板，4℃孵育過夜；3% BSA-PBS室溫封閉1 h；加入血清［PBS 10倍系列稀釋（102～106）］，室溫2 h；加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），室溫孵育30 min；TMB顯色。免疫4次后，動脈取血，經(jīng)Protein G柱純化兔多克隆抗血清。

1.10 重組MPT64蛋白的抗原特異性鑒定 采用Western blot法。將純化的重組蛋白經(jīng)12% SDSPAGE分離后，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入重組MPT64蛋白兔多克隆抗血清（1∶5 000稀釋），4℃孵育1 h；TBST緩沖液（含1×TBS，0.05% Tween 20）洗滌，加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h；TBST洗滌，ECL顯影。

1.11 抗原的血清學評價 采用間接ELISA法測定TB組44份和HC組36份血清中抗MtbIgG或IgA抗體水平。分別以5μg／mL MPT64、GroES和Ag-85A蛋白包被ELISA板，100μL／孔，4℃包被過夜；3% BSA-PBS封閉，加入MPT64兔多克隆抗血清（PBS 1∶2 000稀釋），100μL／孔，室溫2 h；加入HRP標記的羊抗人IgG（1∶20 000稀釋）或HRP標記的鼠抗人IgA（1∶5 000稀釋），室溫孵育30 min；加入TMB，室溫顯色5 min；酶標儀測定450 nm波長處A值。

1.12 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1mpt64基因擴增產(chǎn)物的鑒定mpt64基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見687 bp的特異性條帶，大小與預(yù)期一致，見圖1。

圖1 mpt64基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of mpt64 gene

2.2 重組表達質(zhì)粒的鑒定 重組表達質(zhì)粒pET28ampt64的雙酶切（BamHⅠ／EcoRⅠ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見687 bp的目的基因條帶，見圖2。測序證實，堿基序列與MtbH37Rv基因完全一致，表明mpt64基因片段已正確插入表達載體pET28a（+）中。

2.3 表達及純化產(chǎn)物的鑒定12%SDS-PAGE分析顯示，表達的重組MPT64蛋白相對分子質(zhì)量約24 000，主要以包涵體形式存在，部分以可溶性形式存在；經(jīng)Ni2+-NTA親和柱純化后，純度可達90%，蛋白濃度約2.0mg／mL。見圖3。

2.4 重組MPT64蛋白的免疫原性及抗原特異性ELISA結(jié)果顯示，MPT64兔多克隆抗血清效價可高達1∶2 048 000，表明該重組蛋白具有良好的免疫原性。Western blot分析顯示，純化的MPT64蛋白可與兔多克隆抗血清反應(yīng)，在相對分子質(zhì)量約24 000處可見特異性條帶，見圖4，表明該重組蛋白具有良好的抗原特異性。

2.5 MPT64抗原檢測臨床血清的評價ELISA結(jié)果表明，TB組血清中的MPT64抗原特異性IgG、IgA抗體水平均顯著高于HC組，差異有統(tǒng)計學意義（t分別為5.272和2.130，P均<0.05）；而GroES和Ag85A抗原特異性IgG、IgA抗體水平兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（tGroES分別為1.394和0.920 2，tAg85A分別為0.236 6和1.690；P均>0.05）。見圖5。

圖2 重組表達質(zhì)粒pET28a-mpt64的雙酶切（BamHⅠ／EcoRⅠ）鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pET28ampt64（BamHⅠ／EcoRⅠ）

圖3 表達及純化的重組MPT64蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profile of expressed and purified recombinant MPT64

圖4 重組MPT64蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blotting of recombinant MPT64

圖5 ELISA法檢測受試者血清中的IgG和IgA抗體水平Fig.5 Determination of serum IgA and IgG levels in two groups by ELISA

3 討論

MPT64是Mtb生長早期分泌的蛋白，由Rv1980c基因編碼，包含228個氨基酸，相對分子質(zhì)量約24 000。MPT64是一種僅由毒性分枝桿菌分泌的特殊蛋白，抗原特異性極強，能被CD4+T細胞、CD8+T細胞識別，并能刺激TB感染者機體產(chǎn)生IFNγ，對早期感染Mtb具有保護作用［9-10］，可作為TB的血清學診斷標志物。GroES是Mtb分泌至體外的一種熱休克蛋白，是分枝桿菌體外培養(yǎng)時分泌最多的蛋白之一，可誘導較強的T細胞和B細胞免疫［11-12］。Ag85A是Mtb和BCG培養(yǎng)濾液中分泌蛋白的主要組成部分，可誘導T細胞增殖和IFNγ產(chǎn)生［13］。

血清學檢測具有微創(chuàng)性、操作簡易、適用于肺外結(jié)核和肺結(jié)核等優(yōu)點。CHEN等［14］進行Rv2026c和Rv2421c多抗原的血清學檢測，發(fā)現(xiàn)其Mtb檢測的敏感性和特異性分別為82.5%和88.12%。PUKAZHVANTHEN等［15］測定4種不同抗原的血清抗體水平，發(fā)現(xiàn)單個抗原檢測時敏感性為20%～52.5%，特異性95%，但聯(lián)合4種抗原檢測時，靈敏度升至75%，特異性降至88%。本文以GroES和Ag85A蛋白作為對照抗原，對重組MPT64蛋白在TB組和HC組血清中的IgG和IgA抗體水平進行了初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TB組血清中MPT64抗原特異性IgG和IgA水平均顯著高于HC組（P＜0.05），而兩組間GroES、Ag85A抗原特異性IgA和IgG水平差異則無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；當特異性固定為83%時，通過MPT64特異性IgG檢測可檢出55%的TB患者，而通過GroES或Ag85A特異性IgG檢測則僅可檢出41%或25%的TB患者。綜上所述，MPT64具有較好的TB檢出能力，可作為TB血清學診斷的備選抗原之一。如將MPT64與其他Mtb特異性抗原聯(lián)合使用進行血清學診斷，有望進一步提高TB早期診斷的靈敏度。