劉娟，韓碩，鄒紫雯，李鑫麗，羅林，沈冰蕾

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）主要是指由于單個堿基的改變引起基因組水平上的DNA序列多態(tài)性。SNP主要有2種表現(xiàn)形式：一種稱為轉(zhuǎn)換，即一個嘌呤被另一個嘌呤所代替，或一個嘧啶被另一個嘧啶所代替；一種稱為顛換，即一個嘌呤被一個嘧啶所代替，或一個嘧啶被一個嘌呤所代替。轉(zhuǎn)換和顛換比例約為2∶1，且多發(fā)生在T堿基與C堿基之間［1］?，F(xiàn)階段檢測SNP的方法為將DNA混合后進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增全長測序，與原序列進(jìn)行比對找出SNP位點。

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）作為動物機(jī)體重要的模式識別受體，廣泛存在于各類免疫細(xì)胞表面［2］。Toll樣受體1（Toll-like receptor 1，TLR1）作為TLR家族的主要成員之一，對于引發(fā)和調(diào)節(jié)病原微生物的病原體的免疫反應(yīng)具有重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)TLR1基因可定位在6號染色體上，具有豐富的遺傳多態(tài)性。研究表明，TLR1基因與中國荷斯坦奶牛的許多炎癥相關(guān)疾病相關(guān)［3］，具有顯著影響泌乳性狀和臨床乳房炎的數(shù)量性狀位點。OPSAL等［4］發(fā)現(xiàn)，挪威紅牛TLR1基因第272位的C>T突變對乳房炎發(fā)生無影響。李春苗等［5］發(fā)現(xiàn)，中國荷斯坦奶牛TLR1基因mRNA區(qū)有4個SNP位點，且第1 596位的G>A突變位點產(chǎn)生的不同基因型對體細(xì)胞數(shù)影響極顯著。

泛素化修飾是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后的重要調(diào)節(jié)形式，泛素化的過程與一系列的催化酶有關(guān)。包括泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）、泛素連接酶（E3）［6］。其中E3泛素連接酶是整個泛素化過程中最重要的部分，并且決定了泛素化的特異性。Cbl原癌基因B（Cbl proto-oncogene B，CBLB）是一種E3泛素連接酶，最初通過抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞受體信號而被確定為適應(yīng)性免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)因子。CBLB通過控制參與T細(xì)胞刺激的關(guān)鍵分子來限制T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）的激活［7］，對于維持外周T細(xì)胞耐受性比較重要，并且其缺失會導(dǎo)致TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增加，從而導(dǎo)致自身免疫［8］。最近的研究揭示了CBLB在NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞、整聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo)和樹突細(xì)胞中的其他作用，將CBLB功能的范圍擴(kuò)展至先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。由于CBLB對T細(xì)胞活化、耐受誘導(dǎo)和TH2／9細(xì)胞分化至關(guān)重要［9］。在沒有CBLB情況下增強(qiáng)的抗真菌免疫力可能會導(dǎo)致適應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)。因此，CBLB是先天性抗真菌免疫的第一個負(fù)調(diào)節(jié)因子，抑制CBLB可能通過失調(diào)適應(yīng)性免疫而引起不該出現(xiàn)的副作用，但其在先天免疫反應(yīng)中的作用尚不清楚。

本研究對中國荷斯坦奶牛的TLR1和CBLB基因進(jìn)行SNP檢測并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為中國荷斯坦奶牛的遺傳改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品300頭中國荷斯坦奶牛均購自黑龍江省綏化市裕達(dá)牧業(yè)有限公司。每頭牛尾靜脈采血10 mL，用檸檬酸鈉抗凝處理后置-40℃保存。利用DNA提取試劑盒［購自天根生化科技（北京）有限公司］提取凍存的奶牛血液基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和Nandrop2000儀檢測DNA質(zhì)量和濃度，于-40℃保存。

1.2 引物設(shè)計、合成及目的基因擴(kuò)增 參照NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的牛（Bos taurus）TLR1基因CDS區(qū)（NM_001046504.1）及CBLB基因18外顯子（NM_001205923.2）序列分別設(shè)計特異性引物。TLR1-F序列：5′-ATGCCTGACATCCTCTCACT-3′，TLR1-R序列：3′-TTAATTTATTTCTGCTGCTTTTTCC-5′，目的片段長度預(yù)計為2 148 bp；CBLB-F序列：5′-GCTTATGACATGGGGTGGGA-3′，CBLB-R序列：3′-AGCATCTTGTAAATGGGAGAAAT-5′，目的片段長度預(yù)計為1 240 bp。引物由哈爾濱適合生物有限公司合成。采用DNA混池法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（25μL）：DNA混池模板1μL，上、下游引物各1μL，2×Power Taq PCR Master Mix 12.5μL，用滅菌蒸餾水補(bǔ)充至25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min：94℃變性30 s，TLR1基因59℃退火30s、CBLB基因62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳0.5 h后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

1.3 序列測定及分析 將PCR產(chǎn)物送至爾濱適合生物有限公司進(jìn)行純化后雙向測序。使用chromas軟件、MEGA 6軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，確定中國荷斯坦奶牛TLR1和CBLB基因的SNP位點。利用MWSnap軟件對SNP位點的峰圖高度進(jìn)行測量，并按下式估算各個SNP位點的等位基因頻率。

式中，F(xiàn)表示等位基因B或C在SNP位點中的等位基因頻率；B和C表示等位基因在SNP位點中的峰高。

1.4 生物信息學(xué)分析 中國荷斯坦奶牛TLR1和CBLB基因mRNA二級結(jié)構(gòu)運用在線程序（RNA fold web server服務(wù)器）預(yù)測。分別運用在線分析軟件AAcompldent（https：／／web.expasy.org／protparam／）、expasy（https：／／web.expasy.org／protscale／）、Net-NGlyc1.0（http：／／www.cbs.Dtu.dk／services／NetNGlyc／）、NPS@pages（https：／／npsa-prabi.ibcp.fr／cgibin／secpred_gor4.pl）以及在線程序SWISS MODEL，對其編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、疏水性和親水性、N-糖基化位點、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1TLR1和CBLB基因PCR產(chǎn)物鑒定TLR1基因CDS區(qū)外顯子和CBLB基因的18外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見引物特異性效果較好，PCR產(chǎn)物單一，有明顯的目的條帶，大小與預(yù)期一致，見圖1。

2.2TLR1和CBLB基因測序結(jié)果 利用chromas軟件和MEGA 6軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接后，在TLR1基因CDS區(qū)發(fā)現(xiàn)4個SNP位點，分別為C1424A、A1475C、G1496A和G1550A。其中C1424A位點由苯丙氨酸（Phe）變?yōu)榱涟彼幔↙eu），G1496A位點由色氨酸（Trp）變?yōu)椴环g。A1475C和G1550A位點氨基酸未發(fā)生改變。CBLB基因18外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)1個SNP位點，為G222406T，并且該位點由天冬氨酸（Asp）轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼幔═yr）。見圖2。

圖1 中國荷斯坦奶牛TLR1和CBLB基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of TLR1 and CBLB genes of Chinese Holstein cows

圖2 中國荷斯坦奶牛TLR1和CBLB基因測序及SNP位點比對Fig.2 TLR1 and CBLB gene sequencing and SNP locus comparison of TLR1 and CBLB genes

2.3 SNP位點等位基因頻率估算TLR1基因4個SNP位點突變前后的等位基因頻率均有明顯差異，而CBLB基因SNP位點突變前后等位基因頻率差值為0.024 8，該SNP位點突變前后差異較小，見表1。

表1 中國荷坦奶牛TLR1和CBLB基因SNP位點及等位基因頻率Tab.1 SNP loci and allele frequencies of TLR1 and CBLB genes of Chinese Holstein cows

2.4TLR1和CBLB基因mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 在線程序（RNA fold web server服務(wù)器）預(yù)測結(jié)果顯示，TLR1基因參考序列mRNA二級結(jié)構(gòu)最小自由能為-502.80 kcal／mol，而4個SNP位點C1424A、A1475C、G1496A和G1550A的mRNA二級結(jié)構(gòu)最小自由能分別為-500.30、-504.90、-498.10和-498.50 kcal／mol。其中C1424A、G1496A和G1550A的最小自由能均有所增加，而A1475C的最小自由能有所降低；CBLB基因參考序列mRNA二級結(jié)構(gòu)最小自由能為-201.40 kcal／mol，突變后G222406T位點最小自由能為201.20 kcal／mol，最小自由能有所下降。見圖3。因此，mRNA的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性可能發(fā)生改變，從而可能對蛋白質(zhì)的翻譯發(fā)生影響。

2.5TLR1和CBLB基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析 預(yù)測TLR1和CBLB基因編碼蛋白均屬于不穩(wěn)定蛋白，見表2。因為氨基酸頻率決定翻譯速度，而TLR1基因編碼蛋白質(zhì)由727個氨基酸組成，其中Leu頻率最高，為14.2%，Trp頻率最低，為1.4%，這兩種氨基酸頻率差值為12.8%，見表3。CBLB基因編碼蛋白質(zhì)由983個氨基酸組成，其中脯氨酸（Pro）頻率最高，為12.6%，Trp頻率最低，為0.8%，這兩種氨基酸頻率差值為11.8%，見表4。

表2 中國荷斯坦奶牛TLR1和CBLB蛋白質(zhì)理化特性Tab.2 Physicochemical properties of TLR1 and CBLB proteins of Chinese Holstein cows

圖3 中國荷斯坦奶牛TLR1和CBLB基因mRNA二級結(jié)構(gòu)突變前后對比Fig.3 Secondary structures of mRNA of TLR1 and CBLB genes of Chinese Holstein cows before and after mutation

表3 中國荷斯坦奶牛TLR1蛋白質(zhì)氨基酸的組成Tab.3 Amino acid composition of TLR1 protein of Chinese Holstein cows

表4 中國荷斯坦奶牛CBLB蛋白質(zhì)氨基酸的組成Tab.4 Amino acid composition of CBLB protein of Chinese Holstein cows

2.6TLR1和CBLB基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性及親水性預(yù)測和分析 預(yù)測TLR1和CBLB蛋白質(zhì)均屬于非可溶性蛋白。TLR1蛋白第523位的Val疏水性最強(qiáng)（+3.367），第700位Glu疏水性最弱（-2.800），親水性氨基酸占整條氨基酸肽鏈的47.04%，疏水性氨基酸占整條氨基酸肽鏈的52.96%，總體表現(xiàn)為疏水，見圖4A；CBLB蛋白第26位的Ile疏水性最強(qiáng)（+1.800），第138位Gln疏水性最弱（-3.422），親水性氨基酸占整條氨基酸肽鏈的26.75%，疏水性氨基酸占整條氨基酸肽鏈的73.25%，總體表現(xiàn)為疏水，見圖4B。

圖4中國荷斯坦奶牛TLR1和CBLB蛋白質(zhì)疏水性（A）及親水性（B）預(yù)測分析Fig.4 Prediction of hyrophobicity（A）and hydrophilicity（B）of TLR1 and CBLB proteins of Chinese Holstein cows

2.7TLR1和CBLB基因編碼蛋白質(zhì)的N-糖基化位點分析TLR1編碼蛋白質(zhì)中有6個潛在的N-糖基化位點，分別為Asn76、Asn187、Asn293、Asn306、Asn368和Asn443，見圖5A；CBLB編碼蛋白質(zhì)中有4個潛在的N-糖基化位點，分別為Asn142、Asn602、Asn744和Asn797，見圖5B。

圖5 中國荷斯坦奶牛TLR1（A）和CBLB（B）蛋白質(zhì)N-糖基化位點預(yù)測分析Fig.5 Prediction of N-glycosylation sites of TLR1（A）and CBLB（B）proteins of Chinese Holstein cows

2.8TLR1和CBLB基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測TLR1基因CDS區(qū)的C1424A和G1496A位點為錯義突變，見表1。預(yù)測發(fā)現(xiàn)，突變前后蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變，突變前的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（h）占29.76%，β-折疊（e）占18.28%，無規(guī)則卷曲（c）占51.96%；突變后的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（h）占29.80%，β-折疊（e）占17.25%，無規(guī)則卷曲（c）占52.95%。突變后，a-螺旋和無規(guī)則卷曲比例分別增加了0.04%和0.99%，而β-折疊比例減少了1.03%。見圖6A和圖6B。

CBLB基因18外顯子的G222406T位點為錯義突變，見表1。預(yù)測發(fā)現(xiàn)，突變前后蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變，突變前的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（h）占28.30%，β-折疊（e）占15.09%，無規(guī)則卷曲（c）占56.60%；突變后，無規(guī)則卷曲（c）占56.45%，無規(guī)則卷曲降低了0.15%。見圖6C。

2.9TLR1和CBLB基因編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測TLR1和CBLB蛋白質(zhì)突變前后有明顯變化，與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的結(jié)果相一致，見圖7。

圖6中國荷斯坦奶牛TLR1和CBLB蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)突變前后對比Fig.6 Secondary structures of TLR1 and CBLB proteins of Chinese Holstein cows before and after mutation

圖7 中國荷斯坦奶牛TLR1和CBLB蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)突變前后對比Fig.7 Tertiary structures of TLR1 and CBLB proteins of Chinese Holstein cows before and after mutation

3 討論

近年來，對Toll樣受體家族的基因多態(tài)性的研究成果日益增多。有研究表明，Toll樣樣受體在激活免疫中發(fā)揮重要作用［10］。TLR1基因在動物中的研究已經(jīng)被大量報道。其中VAHANA等［11］發(fā)現(xiàn)，TLR1基因在水牛肝臟、肺臟、脾臟、心臟中表達(dá)量較高，而在腎臟、卵巢中的表達(dá)量較低或者不表達(dá)。但陳亞冰等［12］研究發(fā)現(xiàn)，TLR1基因在牦牛腎臟和卵巢中的表達(dá)量也較高，并且提出了這一現(xiàn)象可能與TLR1基因在牦牛中的局部免疫有關(guān)。RUAN等［13］在2個雜交系及7個純系品種（品系）雞的TLR1-1、TLR1-2基因發(fā)現(xiàn)14個SNP位點，TLR1-2基因發(fā)現(xiàn)13個SNP位點，說明不同品種之間存在抗病性差異。RUSSELL等［14］發(fā)現(xiàn)，該基因5′端-79 T＞G和3′端UTR區(qū)+2 463 C＞T能夠顯著影響奶牛臨床型乳房炎的發(fā)生。王夢琦等［15］研究發(fā)現(xiàn)，TLR1基因的突變影響中國荷斯坦奶牛的日產(chǎn)奶量和體細(xì)胞評分，并且發(fā)現(xiàn)TLR1-245 G＞T突變與中國荷斯坦奶牛臨床型乳房炎的發(fā)生顯著相關(guān)。

目前對CBLB基因的研究多集中在人類疾病中，LOESER等［16］研究表明，CBLB在感染過程中會對T細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)作用，其缺失會增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫。OU等［17］研究表明，CBLB在控制慢性病毒感染和腫瘤中顯示出優(yōu)勢。NANJAPPA等［18］研究表明，CBLB可作為滅活酵母疫苗接種后增強(qiáng)抗真菌CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的潛在靶標(biāo)，從而增強(qiáng)對致命性真菌性肺炎的抵抗力。CBLB缺乏小鼠容易發(fā)展自身免疫，絕大部分的研究表明，這類小鼠對多發(fā)性硬化（MS）的動物模型—實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmuune encephalomyelitis，EAE）有很高的易感性［19-20］。PEER等［21］研究表明，CBLB通過阻止單糖體蛋白（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）在T細(xì)胞中過度產(chǎn)生的致病作用來限制自身免疫。XIAO等［22］研究表明，CBLB是全身性念珠菌病的潛在藥物靶標(biāo)。

關(guān)于CBLB基因的SNP位點的報道相對較少，DONIZ-PADILLA［23］等在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者發(fā)現(xiàn)了CBLB2126（A／G）SNP，并且證明該位點與系統(tǒng)性紅斑狼瘡存在顯著性相關(guān)。通過DAVID在線軟件可以確定CBLB基因參與牛的炎癥反應(yīng)過程。本研究采用DNA混池對中國荷斯坦奶牛CBLB基因18外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法，成功檢測到了1個SNP位點（G222406T），并且該突變位點為錯義突變，氨基酸的改變會導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能發(fā)生改變。

蛋白質(zhì)是基因運行生物學(xué)功能的重要分子，其一級、二級、三級及更高級結(jié)構(gòu)相互影響，從而發(fā)揮特定生理功能。本研究通過對300頭中國荷斯坦奶牛TLR1基因SNP位點的鑒定及mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該基因中C1424A、G1496A、G1550A和A1475C 4個SNP位點的產(chǎn)生，導(dǎo)致其最小自由能改變，最終可能會導(dǎo)致mRNA蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性降低。本研究中因為C1424A和G1496A的錯義突變，導(dǎo)致α-螺旋從29.76%增加至29.80%，β-折疊從18.28%降低至17.25%，無規(guī)則卷曲從51.96%增加至52.95%。CBLB基因G222406T SNP位點的產(chǎn)生，導(dǎo)致其最小自由能均有所降低，最終可能會導(dǎo)致mRNA蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性降低，本研究中因為該位點屬于錯義突變，導(dǎo)致無規(guī)則卷曲從56.60%降低至56.45%，由于中國荷斯坦奶牛TLR1和CBLB蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占主要地位，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時，TLR1和CBLB蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)同樣會發(fā)生改變從而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及其功能。蛋白質(zhì)的糖基化修飾是真核生物的一種最普遍的翻譯后修飾方式，多存在于細(xì)胞外環(huán)境的蛋白質(zhì)中，據(jù)統(tǒng)計，體內(nèi)50%～70%的蛋白質(zhì)可發(fā)生糖基化修飾，越來越多的數(shù)據(jù)表明，糖基化作為一種主要的翻譯后修飾對蛋白質(zhì)功能具有重要影響［24-25］。N-糖基化位點存在的越多，發(fā)生異常的可能性越大，對機(jī)體的相關(guān)免疫應(yīng)答有關(guān)。

綜上所述，本研究通過對中國荷斯坦奶牛TLR1基因CDS區(qū)和CBLB基因18外顯子的SNP位點鑒定和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TLR1基因4個SNP位點中2個錯義突變和CBLB基因SNP位點的錯義突變可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響其功能的改變。300頭中國荷斯坦奶牛TLR1和CBLB基因5個SNP位點的發(fā)生，可能影響奶牛炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展，為中國荷斯坦奶牛炎癥相關(guān)免疫調(diào)節(jié)疾病的研究奠定了基礎(chǔ)，該5個SNP位點可作為中國荷斯坦奶牛抗病育種的候選遺傳標(biāo)記。