魏艷，文朝朝，王晰，王海龍，郭睿，趙虹，張棟，弓韜，孫公勤，于保鋒

山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西太原030001

影響育齡女性不育的因素很多，如卵泡發(fā)生、排卵、早期胚胎發(fā)生及植入等，卵巢早衰及卵巢卵泡發(fā)育缺陷導(dǎo)致的卵巢功能不全已成為女性生育能力的主要原因，該原因使約1%40歲以下的女性不育［1-2］。GPR173為一種高度保守的G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCR），GPCR代表多種疾病的治療靶標(biāo)［3］。NGUYEN等［4］研究發(fā)現(xiàn)，GPR173及其配體與卵泡的發(fā)育有關(guān)，且隨著卵泡的增長，在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)也隨之增加。因此，了解GPR173蛋白的功能對(duì)疾病的治療至關(guān)重要。

菲尼克斯蛋白（Phoenix protein，PNX）為一種新發(fā)現(xiàn)的生殖肽，是GPR173其中一個(gè)潛在配體［5］。MATSUMOTO［6］等研究發(fā)現(xiàn)，因GPCR家族在脊椎動(dòng)物物種中高度保守，也被稱為腦部表達(dá)的超保守受體（super conserved receptor expressed in brain，SREB）家族，該家族成員至少包括SREB1、SREB2及SREB3，GPR173作為SREB亞家族的一部分，也稱為SREB3，在腦部及卵巢中表達(dá)，尤其在人卵巢中高表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)生殖性下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸［6］。營養(yǎng)水平及環(huán)境化學(xué)物質(zhì)可能通過調(diào)節(jié)GPR173的表達(dá)而影響生殖功能，這很有可能是生殖健康的未來治療目標(biāo)［7］。PNX通過GPR173發(fā)出的信號(hào)以激活cAMP-PKA途徑，誘導(dǎo)生殖基因的表達(dá)。同時(shí)，WANG等［8］研究發(fā)現(xiàn)，PNX作為下丘腦衍生的垂體啟動(dòng)因子，通過作用于下丘腦或垂體水平來調(diào)節(jié)HPG軸，進(jìn)而在卵泡發(fā)生中發(fā)揮作用。目前，GPR173作為與卵泡發(fā)育有關(guān)的治療靶點(diǎn)研究甚少。

本研究通過多種生物信息學(xué)在線軟件對(duì)GPR-173蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能及與其相互作用的蛋白進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究GPR173的作用機(jī)制及其作為治療靶點(diǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1 GPR173氨基酸序列 從NCBI（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／protein／）數(shù)據(jù)庫中下載GPR173的氨基酸序列，序列如下：MANTTGEPEEVSGALSPPSASAYVKLVLLGLIMCVSLAGNAILSLLVLKERALHKAPYYFLLDLCLADGIRSAVCFPFVLASVRHGSSWTFSALSCKIVAFMAVLFCFHAAFMLFCISVTRYMAIAHHRFYAKRMTLWTCAAVICMAWTLSVAMAFPPVFDVGTYKFIREEDQCIFEHRYFKANDTLGFMLMLAVLMAATHAVYGKLLLFEYRHRKMKPVQMVPAISQNWTFHGPGATGQAAANWIAGFGRGPMPPTLLGIRQNGHAASRRLLGMDEVKGEKQLGRMFYAITLLFLLLWSPYIVACYWRVFVKACAVPHRYLATAVWMSFAQAAVNPIVCFLLNKDLKKCLRTHAPCWGTGGAPAPREPYCVM。

1.2 生物信息學(xué)預(yù)測分析 采用在線軟件預(yù)測分析GPR173氨基酸序。ProtParam（https：／／web.expasy.org／protparam／）軟件預(yù)測分析其理化性質(zhì)；ProtScale（https：／／web.expasy.org／protscale／）軟件分析其疏水性；SignalP-4.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP-4.0／）軟件預(yù)測分析其信號(hào)肽結(jié)構(gòu)；SecretomeP 2.0 server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SecretomeP／）軟件預(yù)測其分泌蛋白的類型；TMHMM 2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）在線程序分析其跨膜結(jié)構(gòu)；NetNGlyc 1.0 Sever（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／）、NetOGlyc 4.0 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetOGlyc／）及Yin OYang 1.2 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／YinOYang／）軟件預(yù)測其N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)；Netphos 2.0 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos-2.0／）軟件預(yù)測其磷酸化位點(diǎn)；PSORTⅡ（https：／／psort.hgc.jp／form2.html）軟件分析預(yù)測其亞細(xì)胞定位；SOPMA工具（https：／／npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／secpred_sopma.pl）分析預(yù)測其二級(jí)結(jié)構(gòu)及各成分的占比；NCBI中Conserved Domain數(shù)據(jù)庫分析其結(jié)構(gòu)域；SWISS-MODEL建模服務(wù)器（https：／／swissmodel.expasy.org／）分析預(yù)測該蛋白的三維結(jié)構(gòu)；STRING（https：／／string-db.org／）軟件預(yù)測分析其蛋白的網(wǎng)絡(luò)相互作用并進(jìn)行基因功能（Gene Ontology，GO）注釋。

2 結(jié)果

2.1 GPR173蛋白的理化性質(zhì) 經(jīng)ProtParam軟件分析，GPR173蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為41 481.40，分子式為C1911H2944N494O474S33，理論等電點(diǎn)PI為9.36，屬堿性蛋白；組成GPR173的氨基酸有20種，其中丙氨酸（Ala）的含量最多，占比為13.1%，天冬氨酸（Asp）及谷氨酰胺（Gln）的含量最少，占比為1.9%，見圖1；帶正電荷的殘基數(shù)為35個(gè)；帶負(fù)電荷的殘基數(shù)為18個(gè)；半衰期為30 h（哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞）；不穩(wěn)定系數(shù)為38.70，屬穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)<40）；脂肪系數(shù)為95.55，總平均親水性為0.483。經(jīng)ProtScale軟件分析，GPR173氨基酸序列第31位疏水性最大值為3.144，第215位親水性最大值為-2.722，整體親疏水性預(yù)測顯示，GPR173為疏水性蛋白，見圖2。

圖1 GPR173氨基酸組成及占比Fig.1 Amino acid composition and proportion in GPR173

圖2 GPR173親水性及疏水性分析Fig.2 Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of GPR173

2.2 GPR173信號(hào)肽 軟件SignalP-4.0預(yù)測結(jié)果包含C值（表示剪切位點(diǎn)值）、S值（表示是否為信號(hào)肽）、D值（表示是否為分泌蛋白）及Y值（綜合考慮C及S值的1個(gè)參數(shù)），如S均值高于0.5，認(rèn)為存在信號(hào)肽；如D均值高于0.5，則可能為分泌蛋白。結(jié)果顯示，GPR173蛋白第39位氨基酸處，C及Y值達(dá)最高，分別為0.183和0.161，在第36位氨基酸處，信號(hào)肽S值達(dá)最高點(diǎn)，為0.247，1～38位氨基酸序列的S均值為0.130，D均值為0.149，見圖3。推測該蛋白不是經(jīng)典型分泌型蛋白，也不存在信號(hào)肽序列。

2.3 非經(jīng)典型分泌蛋白的預(yù)測SecretomeP 2.0 Server軟件結(jié)果評(píng)價(jià)主要參考NN-score（非經(jīng)典分泌蛋白的決定性評(píng)分），哺乳動(dòng)物序列的NN-score閾值為0.6。結(jié)果顯示，GPR173蛋白氨基酸序列的NN-score為0.126017，推測該蛋白不是非經(jīng)典型分泌蛋白。

2.4 GPR173跨膜結(jié)構(gòu) 結(jié)果顯示，GPR173蛋白的氨基酸序列膜外（紅線）至膜內(nèi)（藍(lán)線）的跨膜螺旋有4個(gè)，分別位于第26～48、98～120、188～210、321～343氨基酸上；膜內(nèi)至膜外的跨膜螺旋有3個(gè)，分別位于第61～83、137～159、289～311氨基酸上；膜外蛋白（位于紅線上）分別位于第1～25、84～97、160～187、312～320氨基酸上；膜內(nèi)蛋白（位于藍(lán)線上）分別位于第49～60、121～136、211～288、344～373氨基酸上。見圖4。

圖3 GPR173信號(hào)肽分析Fig.3 Analysis of signal peptide of GPR173

圖4 GPR173跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Analysis of transmembrane structure of GPR173

2.5 GPR173亞細(xì)胞定位 經(jīng)PSORTⅡ軟件分析，GPR173定位于不同的細(xì)胞器，由大到小的概率依次為質(zhì)膜占56.5%，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)占21.7%，空泡占8.7%，線粒體占4.3%，高爾基體占4.3%，細(xì)胞核占4.3%。GPR173在質(zhì)膜上占比最大，與預(yù)測的跨膜蛋白結(jié)果一致。

2.6 GPR173翻譯后位點(diǎn)修飾GPR173翻譯后經(jīng)NetNGlyc 1.0 Server分析，N-糖基化位點(diǎn)分別在第3及184位氨基酸上；經(jīng)NetOGlyc 4.0 Server分析，O-糖基化位點(diǎn)分別在第4、5及12位氨基酸上，再經(jīng)YinOYang 1.2 Server分析，O-糖基化有7個(gè)位點(diǎn)，分別位于第5、12、19、88、139、238及360位氨基酸上。經(jīng)Netphos 2.0 Server分析，GPR173翻譯后有5個(gè)Ser、1個(gè)Thr及4個(gè)Tyr均可能是蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)。

2.7 GPR173的空間結(jié)構(gòu) 經(jīng)SOPMA軟件分析，GPR173的二級(jí)結(jié)構(gòu)由38.87%的無規(guī)卷曲、46.92%的α-螺旋、12.06%的延伸鏈（β折疊）及2.14%的β-轉(zhuǎn)角組成，其中α-螺旋占比較高，是其主要結(jié)構(gòu)，見圖5。經(jīng)Conserved Domain數(shù)據(jù)庫分析，GPR173蛋白屬7tm_GPCRs超家族，且含1個(gè)7tmA_SREB3_GPR173結(jié)構(gòu)域，見圖6。經(jīng)SWISS-MODEL分析，GPR173蛋白的三維結(jié)構(gòu)中GMQE為0.56，QMEAN為－6.06，序列相似度為30%，見圖7。

2.8 GPR173的相互作用蛋白 結(jié)果顯示，與GPR173蛋白可能有10個(gè)相互作用的蛋白，分別為SMIM2［相互作用的可靠程度（score）：0.669］、TMEM87B（score：0.579）、TSPYL2（score：0.463）、EFHC1（score：0.566）、T HOP1（score：0.516）、GPR157（score：0.511）、GPR174（score：0.575）、GPR144（score：0.596）、GPR176（score：0.538）及GPR20（score：0.477），見圖8。由此推測，GPR173與SMIM20相互作用的可能性最大，與GPR20相互作用的可能性最?。籗MIM20、TMEM87B、TSPYL2、EFHC1及THOP1與GPR是GPCR信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，GPR173可能參與GPCR信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮其作用。經(jīng)GO分析，GPR173作用蛋白基因參與GPCR信號(hào)通路、晝夜行為及正調(diào)節(jié)磷脂酶C激活GPCR信號(hào)通路的細(xì)胞溶質(zhì)鈣離子濃度，見表1。

圖5 GPR173二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Analysis of secondary structure of GPR173

圖6 GPR173功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.6 Analysis of functional domain of GPR173

圖7 GPR173三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Prediction of three-dimensional structure of GPR173 protein

表1 GPR173蛋白的GO分子功能和生物學(xué)過程分類Tab.1 Classifications of GO molecular function and biological process of GPR173 protein

3 討論

研究表明，PNX治療增加了卵母細(xì)胞數(shù)量并改善其細(xì)胞的成熟度［6］。有報(bào)道表明，較大的卵泡與卵母細(xì)胞質(zhì)量的改善相一致，PNX可能通過協(xié)助卵泡生長來提高卵母細(xì)胞成熟度［4，9-10］，由于PNX及GPR173均在卵母細(xì)胞中顯著表達(dá)，因此并不排除PNX與GPR173直接作用于卵母細(xì)胞，進(jìn)而影響卵泡發(fā)育。本研究分析顯示，GPR173是一種堿性穩(wěn)定的疏水蛋白，無信號(hào)肽，既不是經(jīng)典的分泌蛋白，也不是非經(jīng)典分泌型蛋白，有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，ɑ-螺旋是其二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式，屬7tm_GPCRs超家族。

糖基化是常見且重要的蛋白翻譯后修飾方式，廣泛存在于蛋白中，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)及功能具有重要的調(diào)控作用，為一種普遍的生命活動(dòng)調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用［11-12］。利用多種不同在線生物信息學(xué)軟件對(duì)GPR173蛋白的糖基化預(yù)測表明，GPR173蛋白在第3及184位存在N-糖基化位點(diǎn)，兩種軟件對(duì)O-糖基化的分析結(jié)果存在不同，但在第5及12位存在共同的O-糖基化位點(diǎn)。GPR173翻譯后修飾（post-translation modification，PTM）的另1個(gè)潛在位點(diǎn)是細(xì)胞外N-末端尾部的天冬酰胺殘基，該位點(diǎn)是N-糖基化的候選位點(diǎn)，其可促進(jìn)受體與細(xì)胞外環(huán)境的相互作用或協(xié)助配體募集，而所提及的PTM是否與GPR173的功能及活性有關(guān)是未知的［13］，該預(yù)測可能在細(xì)胞生理活動(dòng)中及其疾病的作用機(jī)制中起重要作用。

GO分析顯示，GPR173相互作用蛋白基因主要參與的分子功能是受體活性激活；研究表明，GPCR及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及卵巢顆粒細(xì)胞增殖與卵巢卵泡發(fā)育過程中有一定的作用［14］。GPCR介導(dǎo)的信號(hào)通路主要包括cAMP信號(hào)通路及磷脂酰肌醇信號(hào)通路，cAMP信號(hào)通路主要通過腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)胞內(nèi)cAMP的信號(hào)水平；而磷脂酰肌醇信號(hào)通路則是通過膜受體接受胞外信號(hào)，同時(shí)產(chǎn)生2個(gè)胞內(nèi)信使，分別激活I(lǐng)P3-Ca2+及DG-PKC途徑，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)答。研究表明，皮質(zhì)醇晝夜變化對(duì)卵泡發(fā)育也有一定的影響［15］。

PNX及GPR173均是維持生殖功能所必需的蛋白，其mRNA水平隨著年齡的增加而增加［16］。有研究表明，外源性施用的PNX作用于腦部，用以刺激黃體生成素（luteinizing hormone，LH）在排卵前分泌激增，但在GPR173弓狀核表達(dá)受損時(shí)，不會(huì)發(fā)生上述效應(yīng)［17］，表明GPR173是PNX在大腦中對(duì)生殖激素分泌作用所必需的蛋白，也可能GPR173僅僅作為PNX受體或在激活的神經(jīng)回路的下游表達(dá)［18］；另一種原因可能是GPR173與PNX相互作用對(duì)生殖激素的分泌起作用，如其中1個(gè)蛋白受損或減少就會(huì)使其作用減弱。

本文通過生物信息學(xué)軟件對(duì)GPR173蛋白的結(jié)構(gòu)以及其他特點(diǎn)進(jìn)行分析，為研究該蛋白在疾病中的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，且有可能將其作為未來生殖障礙的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。