楊德奕，趙懿琛，龔偉偉，李昆鵬

1.貴州大學(xué)茶學(xué)院山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)550025；2.武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司，湖北 武漢430223

植物防御素1（Nicotiala alatadefensin 1，NaD1）是植物固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是植物抵御真菌攻擊的第一道防線［1］，一般對(duì)哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞無(wú)毒，對(duì)植物及人類的真菌病原體具有較強(qiáng)抗菌活性［2-3］。NaD1蛋白可在花煙草Nicotiala alata的花芽中提取獲得［4］。研究發(fā)現(xiàn)，在花煙草Nicotiala alata中，NaD1蛋白穿過(guò)真菌細(xì)胞質(zhì)膜及進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)前，與真菌細(xì)胞壁發(fā)生特異性作用，進(jìn)入細(xì)胞后，迅速引發(fā)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），真菌質(zhì)膜發(fā)生透化，導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡［5-7］。NaD1蛋白對(duì)尖孢鐮刀桿菌（Fusarium oxysporum）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、念珠菌（Candida albicans）等多種致病性真菌也具有良好的抗菌活性［8］。另有研究表明，NaD1蛋白可與磷酸酰肌醇4，5-二磷酸發(fā)生特異性、高親和力的相互作用，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞活性的作用［9］，但作用機(jī)制尚未明確。

NaD1蛋白的傳統(tǒng)分離純化方法復(fù)雜，成本較高。甲醇畢赤酵母具有表達(dá)量高、糖基化機(jī)制較接近高等真核生物、分泌蛋白便于純化、可高密發(fā)酵、生長(zhǎng)繁殖迅速、可耐受較高強(qiáng)度的流體靜壓、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［10-11］。研究表明，已有500多種蛋白在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，其中大部分為可投入產(chǎn)業(yè)化的藥用蛋白［12］。畢赤酵母對(duì)原核生物大量繁殖培養(yǎng)較容易，對(duì)真核生物基因產(chǎn)物可進(jìn)行正確折疊及翻譯后修飾加工［13-14］。武如娟［15］將抗菌抗病毒雜合肽Cecropin（1-8）-LL37（17-30）基因克隆至畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA中，表達(dá)純化后每升發(fā)酵液中可提取190.65 mg的重組雜合肽；李旭鋒等［16］將新城疫病毒（Newcastle disease，NDV）HN蛋白的基因克隆至畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA中，表達(dá)純化后可獲得純度高于90%的重組蛋白。本研究將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-NaD1于畢赤酵母GS115中誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行Ni-NTA純化，以期獲得較高純度的重組蛋白NaD1，為后續(xù)NaD1蛋白殺傷真菌及抑制癌細(xì)胞作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-NaD1由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司構(gòu)建（將NaD1基因序列［17］克隆至載體pPIC9K，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證構(gòu)建正確）；載體pPIC9K、感受態(tài)E.coliTOP10及感受態(tài)畢赤酵母GS115均由該公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、甘油（C3H8O3）、葡萄糖（C6H12O6）、甲醇（CH3OH）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA·2Na）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、酪蛋白及咪唑均購(gòu)自北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；內(nèi)切酶SacⅠ、RDB培養(yǎng)基及Geneticin（G418）均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；BMGY液體培養(yǎng)基及YP培養(yǎng)基均由貴州大學(xué)茶學(xué)院山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、小鼠抗NaD1單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、消泡劑、質(zhì)粒提取試劑盒、Ni-NTA柱、0.22μm過(guò)濾器、10 kDa超濾管均由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司提供。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KNaD1經(jīng)內(nèi)切酶SacⅠ線性化后，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)畢赤酵母GS115中（參數(shù)設(shè)置為：電壓1 500 V，時(shí)間5 ms），涂布于RDB+G418平板培養(yǎng)基，于30℃孵育3～4d進(jìn)行篩選。

1.4 陽(yáng)性克隆的鑒定 根據(jù)GenBank中登錄的NaD1基因序列（AF509566.1）的開(kāi)放閱讀框，應(yīng)用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)：5′-GAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTCATGCACCATCACCATCACCATAGAGAATG-3′，R：5′-TGTCTAAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTAGTTATCCATTATCTCTTCTTCAAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為278 bp。引物由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成。挑取篩選的重組陽(yáng)性克隆單菌落，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為：dNTP 1.6μL，10×buffer 2.0μL，上、下游引物各0.2μL，Enzyme 0.2μL，ddH2O補(bǔ)足總體系至20.0μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min；94℃30 s，57℃30 s，72℃90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃7 min。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（未加模板）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將檢測(cè)正確的重組陽(yáng)性克隆送武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司測(cè)序。

1.5 重組蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá) 挑選菌落PCR鑒定陽(yáng)性的克隆，加至1.5 mL BMGY液體培養(yǎng)基中，于30℃，200 r／min搖床培養(yǎng)48 h；靜置5～6 h，棄上清，加入1 mL BMMY液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入200μL含5%甲醇的YP培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；8 929×g離心10 min，取上清，加入150μL TCA，冰浴2 h；重復(fù)離心，棄上清，加入200μL丙酮洗滌沉淀，重復(fù)離心，棄上清，置60℃烘箱烘干15～20 min；加入20μL 1×loading buffer重懸后，進(jìn)行15%SDS-PAGE分析。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染空載體pPIC9K的菌落）。

1.6 重組蛋白的大量表達(dá)及純化 挑取小量誘導(dǎo)表達(dá)水平較高的單菌落，接種于1 L BMGY液體培養(yǎng)基中，于30℃200 r／min培養(yǎng)24 h；4 722×g離心3 min，棄上清，接種于1 L BMMY培養(yǎng)基中，加入200μL消泡劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入1%的甲醇，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h；重復(fù)上步操作，4 722×g離心5 min，取上清，經(jīng)不銹鋼圓盤過(guò)濾器過(guò)濾，透析柱法濃縮至200 mL，即濃縮上清。用1 mol／L Tris（pH 9.0）調(diào)節(jié)濃縮上清pH至8.0；經(jīng)0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾，以1 mL／min的流速上樣Ni-NTA柱，用NTA-0緩沖液（pH 8.0）洗至流出液體不含蛋白，再用250 mmol／L咪唑洗脫，收集洗脫液，經(jīng)10 kDa超濾管超濾濃縮至1～2 mL。

1.7 純化產(chǎn)物的鑒定 采用Western blot法。純化的重組蛋白NaD1經(jīng)15% SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含1%酪蛋白的封閉液于37℃封閉2 h；PBST洗滌3次，加入小鼠抗NaD1單克隆抗體（1∶1 000稀釋），于37℃孵育60 min；PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶3 000稀釋），于37℃孵育60 min；ECL法顯色。另取200μL純化的重組蛋白NaD1，加入2×上樣緩沖液，煮沸10 min，送武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KNaD1的單切酶（SacⅠ）產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)9 572 bp的目的基因片段，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖1。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-NaD1的單酶切產(chǎn)物（SacⅠ）電泳圖Fig.1 Electrophoretic profle of recombinant plasmid pPIC9KNaD1 digested with SacⅠ

2.2 陽(yáng)性克隆的鑒定 經(jīng)電轉(zhuǎn)化獲得的重組陽(yáng)性克隆經(jīng)菌落PCR檢測(cè)，可見(jiàn)278 bp的目的條帶，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖2。測(cè)序結(jié)果表明，目的基因序列與GenBank中登錄的NaD1基因序列（AF509566.1）開(kāi)放閱讀框一致。

圖2 陽(yáng)性克隆的菌落PCR鑒定Fig.2 Identification of positive clones by PCR

2.3 小量誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 所有陽(yáng)性克隆重組蛋白的表達(dá)均不明顯，因此需進(jìn)一步進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。其中5號(hào)陽(yáng)性克隆誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白水平相對(duì)較高，于相對(duì)分子質(zhì)量約20 000處略可見(jiàn)目的蛋白條帶，見(jiàn)圖3。因此，選擇5號(hào)陽(yáng)性克隆進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。

圖3 陽(yáng)性克隆表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profile of expressed product in positive clones

2.4 純化產(chǎn)物的鑒定 純化產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量約20 000，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖4；純化產(chǎn)物可與小鼠抗NaD1單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，且于相對(duì)分子質(zhì)量約20 000處可見(jiàn)特異性結(jié)合條帶，見(jiàn)圖5。純化重組蛋白NaD1純度可達(dá)85%，蛋白得率為0.25mg／L。在可信度conf≥95%，Unique peptides≥1時(shí)，重組蛋白NaD1鑒定到的蛋白質(zhì)總數(shù)為8，覆蓋度（Coverage）最高比對(duì)蛋白為6 His-NaD1，覆蓋度達(dá)12%，相對(duì)分子質(zhì)量為9 700，大小與理論值相符，見(jiàn)表1。上述結(jié)果表明，于酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功純化獲得了重組蛋白NaD1。

圖4 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profile of purified product

表1 純化產(chǎn)物的蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果Tab.1 Protein mass spectrometry of purified product

3 討論

本研究將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-NaD1電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母感受態(tài)GS115中進(jìn)行NaD1重組蛋白分泌表達(dá)。轉(zhuǎn)化重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-NaD1的GS115通過(guò)G418篩選，獲得了陽(yáng)性克隆菌株，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，表達(dá)水平較低，可能是由于小量表達(dá)誘導(dǎo)不足所致。因此，選擇了表達(dá)量相對(duì)較高的單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，大量表達(dá)的重組蛋白經(jīng)Ni-NTA純化后，純化產(chǎn)物可與小鼠抗NaD1單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，于相對(duì)分子質(zhì)量約20 000處可見(jiàn)特異性結(jié)合條帶，條帶大小與重組蛋白NaD1理論值11 000不符，是由于含有His標(biāo)簽所導(dǎo)致的；蛋白條帶呈彌散狀態(tài)，推測(cè)是由于酵母系統(tǒng)表達(dá)中發(fā)生了糖基化修飾［18］及NaD1蛋白形成了多聚體［19］。本研究獲得純化產(chǎn)物的純度為85%，得率為0.25 mg／L，今后將進(jìn)一步優(yōu)化其表達(dá)體系，以期得到更高表達(dá)及純化效率的NaD1蛋白。

綜上所述，本研究于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)了重組蛋白NaD1，并進(jìn)行了純化，獲得了純度較高的重組蛋白NaD1，為后續(xù)NaD1蛋白殺傷真菌和抑制癌細(xì)胞作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。