劉兆祿，朱力，潘超，盧瑛，王恒樑，

1.上海海洋大學(xué)，上海201306；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京100071

百日咳是由百日咳博德特菌引起的急性呼吸道傳染病，其最早于1414年在法國出現(xiàn)，也是世界上使用疫苗控制效果較差的可預(yù)防疾病之一［1］。百日咳的臨床特征為陣發(fā)性或暴發(fā)性的多次快速咳嗽，并伴有特征性的“雞鳴”樣吸氣性吼聲，最常見的并發(fā)癥是繼發(fā)性肺炎。該病多發(fā)于兒童及嬰幼兒年齡段，特別是小于6個月的嬰兒［2］。盡管目前已有針對百日咳的預(yù)防性疫苗且疫苗接種率高，但百日咳仍為兒童死亡的主要病因之一。

天然的絲狀血凝素（filamentous haemagglutinin，F(xiàn)HA）是在細(xì)菌細(xì)胞表面表達的百日咳博德特菌黏附素，也會分泌到細(xì)胞外環(huán)境中，其包含幾個促進細(xì)菌黏附于纖毛呼吸道上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)域，包括保守的三肽序列RGD（Arg-Gly-Asp）、碳水化合物識別結(jié)合域和肝素結(jié)合域［3］。FHA通過RGD與巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞表面的3型補體受體（type 3 complement receptor，CR3）結(jié)合來啟動吞噬作用，然后毒素介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)殺傷抑制作用可促進細(xì)菌存活［4］。為探究FHA最具免疫原性的區(qū)域，ASGARIAN-OMRAN等［5］通過人血清抗體對FHA不同區(qū)域進行測定，證明在FHA氨基酸殘基1877-2250位置能夠誘導(dǎo)最有效的免疫應(yīng)答，是FHA最具免疫顯性的區(qū)域。

志賀毒素B亞單位（shiga toxin B subunit，StxB）早期即被證實可作為載體蛋白在輪狀病毒抗原刺激小鼠后提供保護性黏膜體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)［6］。StxB作為抗原載體與特定細(xì)胞表面受體結(jié)合，使樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）以受體介導(dǎo)的內(nèi)吞方式高效攝取抗原蛋白，顯著活化初始T細(xì)胞進行增殖。同時，StxB還為抗原提供了更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，更利于抗原提呈及淋巴結(jié)引流，有效誘導(dǎo)機體的免疫應(yīng)答。因此，在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，StxB已成為亞單位疫苗有效的載體之一。

本研究以百日咳FHA氨基酸殘基1877-2250片段與StxB作為融合蛋白構(gòu)建亞單位疫苗，并分析其免疫原性和免疫保護效果，為百日咳疫苗的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及FHA片段StxB序列載體及表達載體pET-28a（+）由軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所八所二室保存；感受態(tài)大腸埃希菌DH5α、BL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；百日咳Bp148株菌由北京兒童醫(yī)院姚開虎教授惠贈；FHA氨基酸殘基1877-2250片段由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 實驗動物SPF級BALB／c小鼠，5～6周齡，雌性，體重18 g，購自北京維通利華公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，使用許可證號：1100111911040351。在軍事醫(yī)學(xué)研究院動物中心（AAALAC認(rèn)證）根據(jù)國家科技部《實驗動物管理條例》飼養(yǎng)。

1.3 主要試劑T4 DNA連接酶和DNA marker購自日本TaKaRa公司；蛋白定量試劑盒、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購自美國Thermo Fisher Scientific公司；IPTG購自美國Amresco公司；氫氧化鋁佐劑購自美國Sigma-Aldrich公司；10×TBS、PCR2×Super Pfx MasterMix酶、質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；HRP-Anti-6×His tag購自上海Abmart生物醫(yī)藥有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京TransGen Biotech有限公司；兔源補體由中國食品藥品檢定研究院提供；無水甲醇、甘氨酸和Tris購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.4 引物設(shè)計及合成 通過DNAclub軟件設(shè)計合適的引物擴增StxB和FHA1877-2250片段，并在StxB的3′端和FHA1877-2250的5′端添加一段接頭蛋白GGGS序列（GGCGGATCCGGC）將兩個片段連接在一起。FHA1877-2250片段引物序列：FHA-F1：5′-CGGAATTCGACGAGCACCGTCACCTGCTGAACG-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點），F(xiàn)HA-R1：5′-GCCTCGAGACCATCCGCCAGGCTGGTCTGC-3′（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點），擴增片段大小為1 134 bp。StxB片段引物序列：StxB-F1：5′-CGGAATTCATGAAAAAAACATTATTAATAGCTGC-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點），StxB-R1：5′-ACGAAAAATAACTTCGCTGAATCCCCCTCC-3′，擴增片段大小為267 bp。所有引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.5 各目的片段的擴增 以帶有FHA1877-2250片段的質(zhì)粒為模板，利用引物FHA-F1和FHA-R1進行PCR擴增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性6 min；95℃變性30 s，58℃退火25 s，72℃延伸30 s，共25個循環(huán)；72℃終延伸8 min。以帶有StxB片段的質(zhì)粒為模板，利用引物StxB-F1和StxB-R1進行PCR擴增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性6 min；95℃變性30 s，58℃退火15 s，72℃延伸30 s，共25個循環(huán)；72℃終延伸8 min。以擴增片段StxB和FHA1877-2250為模板，通過引物StxBF1和FHA-R1擴增融合片段StxB-Fha1877-2250。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性6 min；95℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸30 s，共25個循環(huán)；72℃終延伸8 min。擴增片段均經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將StxB-Fha1877-2250、FHA1877-2250片段和載體pET-28a（+）分別經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收，通過T4 DNA連接酶連接，分別構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a-StxB-Fha1877-2250和pET-28a-FHA1877-2250。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，涂布于含卡那霉素（50μg／mL）的LB平板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆，經(jīng)PCR驗證，陽性單克隆送天一輝遠(yuǎn)公司測序，驗證引物序列：FHA-F：5′-GCAACGTTGGAAGGATTTCAAAGCGG-3′，T7-Ter-R：5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。

1.7 目的基因的誘導(dǎo)表達 將測序正確的重組表達 質(zhì) 粒pET-28a-StxB-Fha1877-2250、pET-28a-FHA1877-2250轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），涂布于含卡那霉素（50μg／mL）的LB平板上，隔夜挑取單克隆，接種于含卡那霉素（50μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中，置28℃，220 r／min振蕩搖床中培養(yǎng)至A600值達0.6左右時，加入終濃度為1 mmol／L的IPTG誘導(dǎo)12 h，取1 mL菌體，加入90μL ddH2O重懸，再加入90μL 2×SDS Buffer充分混勻，沸水浴10 min，進行12%SDS-PAGE分析。

1.8 表達產(chǎn)物的Western blot鑒定 表達的重組蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用封閉液（1 g脫脂奶粉加入20 mL TBST）于37℃恒溫箱中封閉1.5 h；加入His-tag抗體（1∶5 000稀釋），37℃孵育1 h；1×TBST清洗3次，每次8 min，在顯影儀上顯影。設(shè)置顯影曝光時間為15 min。

1.9 重組蛋白的純化與復(fù)性 培養(yǎng)500 mL表達菌，離心棄上清，將菌體沉淀用上樣緩沖液A1（0.5 mol／L NaCl，13.3 mL Tris-HCl，0.1 mmol／L Imidazole，pH 7.5）重懸，用細(xì)胞破碎儀破碎菌體，離心取破碎沉淀，用含尿素的緩沖液A2（0.5 mol／L NaCl，13.3 mL／L Tris-HCl，0.1 mmol／L Imidazole，8 mol／L Urea，pH 7.5）重懸菌液，待破碎菌體完全溶解后，6 941×g離心10 min，取上清進行純化。將鎳柱用10倍柱體積的緩沖液A2進行平衡，再將蛋白樣品用4 mL／min的流速上樣，最后以5倍柱體積的洗脫液（0.5 mol／L NaCl，13.3 mL／L Tris-HCl，8 mol／L Urea，0.5 mol／L Imidazole，pH 7.4）洗脫，收集目的蛋白。洗脫后的蛋白加入透析袋中，4℃環(huán)境下復(fù)性，復(fù)性后蛋白最終透析于儲存液1×PBS（pH 8.0）溶液6～8 h。透析復(fù)性結(jié)束后，上清用0.22μm濾器過濾后分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 動物分組及免疫 將30只健康BALB／c小鼠隨機分為3組：StxB-Fha1877-2250、FHA1877-2250和對照組，每組10只。前兩組免疫蛋白2.5μg／只+1／10體積的氫氧化鋁佐劑，免疫劑量為100μL／只，對照組免疫等體積的PBS。所有小鼠均經(jīng)皮下免疫3次，間隔2周。末次免疫后10 d經(jīng)尾靜脈采血，4℃隔夜后5 039×g離心7 min分離血清，測定小鼠血清抗體水平。

1.11 小鼠血清抗體水平的檢測 采用間接ELISA法。以帶有GST標(biāo)簽的FHA1877-2250蛋白作為包被抗原，加入96孔板，100μL／孔，含GST-Fha1877-2250蛋白10μg，4℃包被過夜；次日用TBST洗滌3次，加入5%脫脂牛奶，37℃封閉1 h；加入倍比稀釋的小鼠血清，37℃孵育1 h；用PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶20 000稀釋），37℃孵育1 h；用PBST洗滌3次，加入TMB溶液，避光顯色15 min；加入終止液H2SO4終止5 min后，用酶標(biāo)儀讀取波長490 nm處吸光度值。以對照組小鼠血清平均A490值的2.1倍為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，計算免疫動物抗體滴度。

1.12 血清體外殺菌試驗 將百日咳Bp148株培養(yǎng)至A600為2.0時，用生理鹽水稀釋至菌濃度為100～200 CFU／10μL，取10μL稀釋的菌液，與倍比稀釋的10μL血清（預(yù)先58℃水浴30 min，以滅活其中的補體成分）混合，37℃孵育1 h；加入20μL補體充分混勻，37℃孵育1 h；全部涂LB平板，37℃溫箱培養(yǎng)5 d，計數(shù)平板菌落總數(shù)，計算殺菌率。

1.13 動物攻毒保護試驗 末次免疫后第14天，對3組小鼠腹腔接種2倍半數(shù)致死劑量（1.21×108CFU）的百日咳Bp148株菌液，感染后觀察14 d，統(tǒng)計小鼠死亡情況。

1.14 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Graphpad Prism 7.00軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，通過非配對t檢驗，方差不齊經(jīng)Welch矯正分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 擴增產(chǎn)物的鑒定StxB、FHA1877-2250、StxB-Fha1877-2250片段的擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別可見約250、1 100和1 500 bp的特異條帶，大小均與預(yù)期一致，見圖1。

圖1 StxB、FHA1877-2250、StxB-Fha1877-2250基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of StxB，F(xiàn)HA1877-2250 and StxB-Fha1877-2250 genes

2.2 重組表達質(zhì)粒的鑒定 菌落PCR驗證結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-28a-StxB-Fha1877-2250和pET-28a-FHA1877-2250的單克隆均可擴增出351 bp的特異片段，與理論序列大小一致，見圖2。陽性單克隆的StxBFha1877-2250測序結(jié)果與GenBank中登錄的cDNA序列（BX470248.1）進行比對，結(jié)果100%同源，表明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.3 表達產(chǎn)物的鑒定12%SDS-PAGE分析顯示，與未誘導(dǎo)菌相比，誘導(dǎo)菌在相對分子質(zhì)量約43 000、51 000處有明顯表達的蛋白條帶，與目的蛋白FHA1877-2250、StxB-Fha1877-2250的預(yù)測值相符。Western blot進一步驗證了目的蛋白表達正確。見圖3。

2.4 純化產(chǎn)物的鑒定 復(fù)性后的蛋白經(jīng)12% SDSPAGE分析，純度超過98%，見圖4。經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒檢測，純化后StxB-Fha1877-2250蛋白含量為399.36μg／mL，F(xiàn)HA1877-2250蛋白含量為269.79μg／mL。

2.5 免疫小鼠抗體水平 間接ELISA檢測結(jié)果顯示，末次免疫后第10天，StxB-Fha1877-2250和FHA1877-2250組小鼠均能產(chǎn)生抗FHA的特異性抗體，抗體效價與對照相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為17.92和20.43，P均<0.000 1），且StxB-Fha1877-2250組相比于FHA1877-2250組能夠產(chǎn)生更高水平的特異性抗體（F=3.81，P=0.001 7），見圖5。表明重組蛋白StxBFha1877-2250免疫小鼠后能有效刺激機體產(chǎn)生特異性B細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖2 重組表達質(zhì)粒的PCR驗證Fig.2 Verification of recombinant plasmid by PCR

圖3 重組蛋白的SDS-PAGE（A）及Western blot（B）鑒定Fig.3 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）profiles of recombinant proteins

圖4 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profile of purified recombinant proteins

圖5 ELISA檢測各組免疫小鼠血清中的抗體滴度Fig.5 Determination of serum antibody titers of mice in various groups by ELISA

2.6 血清體外殺菌活性StxB-Fha1877-2250和FHA1877-2250組初始濃度的血清幾乎可達到80%的殺菌效果，但當(dāng)血清稀釋至80倍后，殺菌效果明顯下降，兩組血清的殺菌效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.435，P=0.1850），但StxB-Fha1877-2250組的血清殺菌效率比FHA1877-2250組略好。見圖6。

2.7 動物攻毒保護效果 攻毒18 h后，小鼠出現(xiàn)活動減少、精神萎靡等癥狀；24 h后，3組小鼠開始死亡；72 h后，對照組小鼠全部死亡，而FHA1877-2250組小鼠在4 d內(nèi)有6只死亡，StxB-Fha1877-2250組小鼠有4只死亡，其余小鼠在經(jīng)歷萎靡不振后慢慢恢復(fù)健康。StxB-Fha1877-2250和FHA1877-2250組小鼠小鼠存活率與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P分別為0.000 5和0.004 0）；StxB-Fha1877-2250組與FHA1877-2250組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.363 5）。見圖7。表明融合蛋白StxB-Fha1877-2250具有較好的潛在保護效果，有效保護率為60%。

圖6 不同稀釋度血清補體殺菌活性Fig.6 Complement bactericidal activity of serum at different dilutions

圖7 攻毒后各組小鼠的存活情況Fig.7 Survival of immunized mice after challenge

3 討論

通過疫苗接種獲得的免疫不是終生的，其保護效果在4～10年內(nèi)趨于減弱，使現(xiàn)今百日咳的發(fā)病率重新升高。因此，開發(fā)新一代疫苗需進一步研究百日咳博德特菌的發(fā)病機制和疫苗的免疫效果［7］。亞單位疫苗免疫原性低是普遍存在的問題，進入機體后無法產(chǎn)生充分刺激，對免疫系統(tǒng)激活能力差，可采用多種疫苗提送系統(tǒng)（如胞外囊泡［8］、自組裝蛋白納米顆粒［9］、病毒樣顆粒［10］等）促進抗原更高效地被抗原提呈細(xì)胞識別與遞送，激發(fā)T細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答，相關(guān)研究也在進行中。

作為百日咳博德特菌的主要外膜蛋白，F(xiàn)HA不僅豐度較高，同時也是現(xiàn)今百日咳無細(xì)胞疫苗（acelluar pertussis vaccine，apv）的主要組成成分。本實驗將StxB片段構(gòu)建至FHA1877-2250N-端進行融合表達，純化的StxB-Fha1877-2250蛋白免疫動物后用Bp146菌株攻擊對其免疫效果進行評價。結(jié)果顯示，F(xiàn)HA1877-2250組小鼠的保護率達40%，即單一的FHA1877-2250抗原能夠刺激機體產(chǎn)生一定的免疫保護，與ASGARIANOMRAN等［5］報道一致；在此基礎(chǔ)上，融合了StxB的StxB-Fha1877-2250組保護率又有所提高，達60%。雖然在之后的體外殺菌試驗中兩組并無明顯差異，但通過間接ELISA檢測的StxB-Fha1877-2250抗體效價最高可達1∶3 200，證實StxB與FHA1877-2250融合有助于提高單抗原的免疫原性和免疫保護性。

通常，關(guān)于StxB蛋白制備的信息很少，且多數(shù)報道與StxB融合蛋白有關(guān)［11］。這種小尺寸蛋白質(zhì)在原核宿主微生物（包括大腸埃希菌）中包含3個二硫鍵，因此其作為包涵體以非活性和不溶性蛋白產(chǎn)生。當(dāng)在大腸埃希菌中過表達時，由于包涵體的形成，在隨后的進一步處理中最終獲得的StxB數(shù)量可能會受到限制。另外，大腸埃希菌自然產(chǎn)生高度免疫原性的內(nèi)毒素，也會限制這種材料的應(yīng)用。雖然目前已開發(fā)了不產(chǎn)生內(nèi)毒素的大腸埃希菌系統(tǒng)［12-13］，但還需更多驗證來確定它們是否適用于生產(chǎn)StxB片段?？偟膩碚f，生物技術(shù)生產(chǎn)StxB片段或由StxB片段和具有特定功能的蛋白質(zhì)組成更復(fù)雜的融合蛋白在技術(shù)上是可行的［14］。

總之，基于StxB的藥物遞送系統(tǒng)具有將小分子和大分子藥物遞送至細(xì)胞內(nèi)的載體潛力。多抗原組合或融合表達有利于研發(fā)多樣性的亞單位疫苗，是開發(fā)廣譜疫苗的研究思路。因此，篩選結(jié)構(gòu)更為保守、免疫原性更好的抗原與適合的載體進行融合或組合，將對百日咳亞單位疫苗的研究帶來幫助。本實驗以百日咳FHA1877-2250蛋白為研究對象，成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒，并經(jīng)純化復(fù)性獲得百日咳StxBFha1877-2250融合蛋白。通過動物試驗、間接ELISA及體外殺菌試驗證實，StxB-Fha1877-2250蛋白具有更良好的免疫原性和反應(yīng)原性，可作為具有潛力的百日咳亞單位疫苗之一。