陳依淼，劉偉,2，于澤，牛雅寧，姜寶杰*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 理工系，河北 滄州 061100；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071001)

蝦醬是渤海等中國沿海地區(qū)以及東南亞地區(qū)等的特色調(diào)味品，它是用蝦絲加入鹽并研磨成的黏稠狀進(jìn)而經(jīng)過發(fā)酵后的醬食品[1]，是許多料理的必備調(diào)味品之一。蝦醬在長時間的貯藏發(fā)酵過程中發(fā)生了一系列反應(yīng)，包括蛋白質(zhì)分解為氨基酸、脂肪轉(zhuǎn)化為脂肪酸等，同時鈣元素經(jīng)過一系列化學(xué)變化易于被人體吸收。所以，蝦醬具有獨特的風(fēng)味，同時也是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪酸和鈣的來源[2]。

在蝦醬的生產(chǎn)過程中，同時進(jìn)行了微生物變化和生化反應(yīng)。自然發(fā)酵產(chǎn)品的微生物菌群在產(chǎn)品感官、品質(zhì)中起著重要的作用[3]。本文采用菌種篩選純化培養(yǎng)的方法，從黃驊市特色蝦醬(高鹽蝦醬和低鹽蝦醬)中分離篩選優(yōu)勢細(xì)菌[4]。分離純化得到的有益菌株可作為微生物農(nóng)藥、生防菌載體等[5-6]，對于生物學(xué)改造和食品的生產(chǎn)工藝改善具有研究價值，為今后在調(diào)味品生產(chǎn)中開發(fā)和利用乳酸菌提供了理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑和樣品

本實驗所用的高鹽和低鹽蝦醬在黃驊市當(dāng)?shù)刭徺I，乙醇為北京化工廠生產(chǎn)，其他試劑均為國藥集團(tuán)生產(chǎn)。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 MRS培養(yǎng)基

準(zhǔn)確稱量20 g蛋白胨、10 g酵母膏、20 g牛肉膏、4 g檸檬酸氫二銨、40 g葡萄糖、2 mL吐溫80、10 g乙酸鈉、4 g磷酸氫二鉀、1.16 g硫酸鎂、0.5 g硫酸錳、36 g脂。

將上述成分加入到含有2 L蒸餾水的燒杯中，充分加熱溶解，再轉(zhuǎn)移至2 L容量瓶中，定容。分裝于500 mL錐形瓶后，于121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

1.1.2.2 LB培養(yǎng)基：

在475 mL H2O中加入胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，定容至100 mL，于121 ℃高溫滅菌15 min，備用。

1.1.3 主要試劑與儀器

實驗所需的儀器見表1。

表1 實驗儀器和設(shè)備Table 1 The experimental instrument and equipment

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)菌的分離篩選

在無菌條件下取少量均質(zhì)后的蝦醬樣品放置于燒杯中，用無菌水進(jìn)行10倍梯度濃度稀釋，稀釋倍數(shù)為101～105倍。分別取0.2 mL稀釋倍數(shù)為103、104、105的菌液涂布在MRS固體培養(yǎng)基上，每個濃度做3個平行實驗，且每組設(shè)置一個相同條件的空白對照培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)并記錄。

挑取單菌落，平板劃線MRS培養(yǎng)基在37 ℃純化培養(yǎng)48 h。觀察菌落在平板中的形態(tài)，革蘭氏染色后鏡檢，若菌落形態(tài)不單一，則存在雜菌。重復(fù)上述操作，直至在進(jìn)行顯微鏡檢測時菌落形態(tài)單一，甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

以液體LB培養(yǎng)的菌液為模板，采用通用引物27f/1492r 擴(kuò)增16S rDNA，PCR體系及程序參考其他文獻(xiàn)報道方法[7-8]。 PCR體系(50 μL)：ddH2O 32 μL、菌液5 μL、PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、上下游引物各1.5 μL和ExTap 1 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s；45 ℃退火30 s；72 ℃延伸 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。

電泳檢測條帶單一后，PCR 產(chǎn)物送交天津擎科生物公司進(jìn)行測序分析。

1.2.3 菌株的抗生素抗性實驗

使用MRS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基滅菌后分別加入濃度為100，200，500，1000 μg/mL的無菌氨芐溶液[9]，振蕩混勻倒板，并設(shè)置空白對照組，每組3個平行實驗。在平板中滴加5 μL的菌液進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)2 d后用十字測量法測量菌落直徑d(cm)并記錄。

1.2.4 菌株產(chǎn)酸能力特性實驗

因為所分離出的細(xì)菌大部分是乳酸菌，所以對其產(chǎn)酸能力進(jìn)行測定。將菌株接種到含有5%濃度的CaCO3的MRS夾層固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在37 ℃培養(yǎng)2 d后用十字測量法測量一次菌落直徑D(cm)和溶鈣圈直徑d(cm)。以溶鈣圈直徑d(cm)/菌落直徑D(cm)×100%計算溶鈣圈直徑比值[10]。

1.2.5 生長曲線的測定

對GYXJ-1菌株生長速度進(jìn)行生長曲線的測定。將提前活化的種子液按10%接種量(15 mL)接種至裝有135 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，于37 ℃下200 r/min搖瓶培養(yǎng)。分光光度儀預(yù)熱結(jié)束后，在波長600 nm的紫外光下進(jìn)行測定，每1 h取樣一次，同時準(zhǔn)備空白培養(yǎng)基進(jìn)行對比測量，測OD600 nm值，連續(xù)測定24 h。以時間為橫坐標(biāo)，OD600 nm值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線圖[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察

從低鹽蝦醬樣品中共分離得到10株菌，編號為 XJ-1、XJ-2、XJ-3、XJ-4、XJ-5、XJ-6、XJ-7、XJ-8、XJ-9、XJ-10。從高鹽蝦醬樣品中共分離得到7株菌，編號為GYXJ-1、GYXJ-2、GYXJ-3、GYXJ-4、GYXJ-5、GYXJ-6、GYXJ-7。將這些菌劃線接種于MRS 固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后，MRS 固體培養(yǎng)基上有較小的單一菌落出現(xiàn)，所有菌落均呈現(xiàn)餅狀，乳白色，表面光滑，菌落中央呈峰狀。鏡檢菌株呈球狀單個或成對，無芽孢存在，革蘭氏染色均為陽性[13]。

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將分離的17 株細(xì)菌菌株的16S rDNA分析結(jié)果進(jìn)行序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自于高鹽蝦醬的7株菌均屬于葡萄球菌，其中4株菌屬于腐生葡萄球菌，2株屬木糖葡萄球菌，1株屬阿爾萊特葡萄球菌；來自于低鹽蝦醬的10株菌全部屬于格氏乳球菌，見表2。

表2 菌種鑒定表Table 2 The identification of strains

2.3 菌株的氨芐抗性研究

運用瓊脂稀釋法，通過十字交叉法測量菌落直徑對培養(yǎng)成功的17株菌株進(jìn)行耐藥性檢驗，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示：GYXJ-2、GYXJ-4、GYXJ-6、XJ-7和XJ-8對氨芐有非常強(qiáng)的抗性，即使在氨芐濃度為1000 mg/L條件下，其生長也不受影響。此外，GYXJ-1、GYXJ-3、XJ-4和XJ-6對氨芐均有不同程度的抗性。其余8株菌對氨芐的耐受性較差，即使在100 mg/L濃度條件下依然不能生長。

表3 菌種的氨芐抗性表Table 3 The resistance of ampicillin of strains

2.4 菌株產(chǎn)酸能力特性研究

測定了從低鹽蝦醬中分離出的10株乳球菌的溶鈣圈水平，用以鑒別其產(chǎn)酸能力，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示：溶鈣能力最高的是XJ-4，溶鈣圈直徑比值是114.38%；溶鈣圈能力最低的是XJ-1，溶鈣圈直徑比值是104.02%。由結(jié)果可知，這些菌株均有明顯的溶鈣圈，說明這10株乳酸菌菌株均具有良好的產(chǎn)酸能力[14-15]。

圖1 各菌株產(chǎn)生的溶鈣圈直徑比Fig.1 The diameter ratio of dissolued calcium produced by each strain

2.5 生長曲線測定

為了更好地研究黃驊蝦醬中細(xì)菌的生長規(guī)律，以GYXJ-1為研究菌株，測定了它的生長曲線。以時間為橫坐標(biāo)，OD600 nm值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線圖，結(jié)果見圖2。乳酸菌的生長曲線說明前2 h是該菌的延滯期，在此期間菌幾乎不繁殖，這是因為菌株處在新的生長環(huán)境，需要進(jìn)行環(huán)境的適應(yīng)，通過吸收營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生為細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備的輔酶和產(chǎn)物。在對滯后期進(jìn)行短暫(約2 h)調(diào)整后，進(jìn)入對數(shù)生長期，在此期間菌體呈指數(shù)倍增。11 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，在15 h時菌體密度達(dá)到最高，死亡菌的數(shù)量逐漸超過新生菌的數(shù)量，并且種群中的活細(xì)菌數(shù)量減少，所以在15 h后OD值出現(xiàn)些許下降,結(jié)果表明該菌呈現(xiàn)出典型的細(xì)菌生長規(guī)律。

圖2 GYXJ-1的生長曲線Fig.2 The growth curve of GYXJ-1

3 結(jié)論

本文通過對從黃驊特產(chǎn)蝦醬中分離篩選的17株優(yōu)勢細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)鑒定與分子鑒定，確定了優(yōu)勢細(xì)菌中7株屬葡萄球菌，10株屬格氏乳球菌。測定了格氏乳球菌產(chǎn)酸能力，發(fā)現(xiàn)均具有良好的產(chǎn)酸能力。對17株菌的耐藥性進(jìn)行了檢測，顯示17株菌中5株菌對氨芐具有非常強(qiáng)的耐受性，4株菌對氨芐有較強(qiáng)的抗性，其余8株菌對氨芐表現(xiàn)出不耐受性。