寧亞維，劉 茁，楊 正，馬俊美，范素芳，李 強,*，張 巖,*

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050000）

近年來，食物過敏在世界范圍內(nèi)迅速增加，已經(jīng)成為一個備受關(guān)注的國際公共衛(wèi)生問題[1]。牛奶過敏是常見的食物過敏之一，發(fā)病率在人群中分布廣泛，約0.3%～7.5%[2]。尤其是2 歲以下兒童發(fā)病率最高，這可能與嬰幼兒長期接觸以牛乳為原料的配方奶粉有關(guān)[3-4]。而牛奶營養(yǎng)豐富是食品加工中常用的原輔料，不同食品間共用生產(chǎn)線的不充分清潔會增加交叉接觸的可能性，增大過敏人群的暴露風(fēng)險。對此許多國家已經(jīng)制定了食品過敏原強制標(biāo)識法規(guī)，以保護消費者免受食品過敏侵害[5-7]，某些特定產(chǎn)品中已經(jīng)有“無牛奶”標(biāo)簽[4,8]。而目前我國過敏原研究尚處于初始階段，僅在GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》和GB/T 23779—2009《預(yù)包裝食品中的致敏原成分》中推薦企業(yè)自行標(biāo)識以提醒消費者[9-11]。因此，為降低牛奶過敏消費者的健康隱患，促進過敏原標(biāo)識規(guī)范化和保障我國加工食品的出口貿(mào)易，建立可靠、靈敏的檢測方法十分必要。

目前，用于牛奶過敏原檢測技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[12-14]法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[15-17]法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[18-20]法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）[5,21-22]法。目前，ELISA方法最為成熟，但由于各式各樣的食品熱加工手段會破壞目標(biāo)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使目標(biāo)致敏蛋白不能被特異性抗體識別，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果[23]。而PCR法是對致敏蛋白的DNA進行間接檢測，不受加工方式的影響，但核酸提取過程繁瑣，易發(fā)生污染出現(xiàn)假陽性。相比于傳統(tǒng)的PCR法，新興的LAMP法不僅簡化了復(fù)雜的操作流程，還可以達到更高的靈敏度，但仍面臨擴增產(chǎn)物易污染的問題[24-25]，且不能對復(fù)雜基質(zhì)中的多種過敏原進行高通量檢測。近年來，LC-MS法被廣泛應(yīng)用于牛奶過敏原的檢測[4,26-28]，可以有效解決ELISA的假陰性及PCR的假陽性弊端，如Lamberti等[4]采用質(zhì)譜法檢測餅干中的αs1-酪蛋白，定量限（limit of quantitation，LOQ）為4 μg/g；Lai Shiyun等[27]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法檢測奶制品中的α-乳白蛋白，LOQ為50 μg/g；Zhang Jingshun等[28]采用UPLC-MS/MS法檢測奶制品中的乳鐵蛋白，LOQ為3 μg/g。但其忽略了單一致敏蛋白在加工過程中熱變性或定量限等問題造成的假陰性。

基于質(zhì)譜技術(shù)高通量檢測的優(yōu)點，本實驗擬篩選牛奶過敏原β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白的特征肽段，開發(fā)一種UPLC-MS/MS法對食品中的β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白進行同時檢測，以期為食品中牛奶過敏原的標(biāo)簽監(jiān)管和準(zhǔn)確定量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面粉、配料中含牛奶和不含牛奶的8 種樣品 市售。

TPEVDDEALEK（96.69%）、VLVLDTDYK（97.26%）、YLGYLEQLLR（98.80%）、HQGLPQEVLNENLLR（95.83%）、FFVAPFPEVFGK（97.33%）、TVYQHQK（96.99%）、FALPQYLK（95.68%）、NAVPITPTLNR（99.91%） 上海強耀生物科技有限公司；β-乳球蛋白（90%，來源于牛乳）、α-酪蛋白（70%，來源于牛乳）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、碳酸氫銨、甲酸（均為質(zhì)譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；正己烷、乙腈（均為質(zhì)譜純） 美國Fisher Scientific公司；TPCK-胰蛋白酶（生物級） 美國AB SCIEX公司；實驗室用水均為Watsons蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾離心管（0.5 mL，10 kDa）、Easy-nLC 1000-Q Exactive納升液相色譜-串聯(lián)軌道阱高分辨質(zhì)譜 美國Thermo Scientific公司；UPLC-Triple Quad 6500＋超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（配電噴霧離子源及MultiQuant 3.0.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國AB SCIEX公司；C18毛細富集柱（100 μm×4 cm，5 μm，120 ?）、C18毛細分析柱（75 μm×15 cm，5 μm，120 ?） 北京樂潤峰科技有限公司；Proteonavi色譜柱（2.0 mm×150 mm，5 μm） 日本Shiseido公司。

1.3 方法

1.3.1 儲備液的配制

精密稱取TPEVDDEALEK、VLVLDTDYK、YLGYLEQLLR、HQGLPQEVLNENLLR、FFVAPFPEVFGK、TVYQHQK、FALPQYLK、NAVPITPTLNR各1 mg于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，配制成100 μg/mL的特征肽段混標(biāo)儲備液。再分別稱取22.22 mgβ-乳球蛋白、28.57 mgα-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，配制成2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲備液。其中α-酪蛋白包括αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白，且其含量比為4∶1。

1.3.2 樣品前處理

采用正己烷對富含脂肪的食品基質(zhì)進行脫脂處理，取0.1 g樣品用蒸餾水稀釋至10 mL，取500 μL樣品稀釋液加入10 μL 500 mmol/L DTT溶液混勻，于70 ℃水浴反應(yīng)30 min，然后加入30 μL 500 mmol/L IAA溶液于室溫下避光靜置30 min。向上述混合液中加入420 μL 500 mmol/L NH4HCO3溶液和30 μL 200 μg/mL TPCK-胰蛋白酶溶液混勻，于37 ℃水浴振搖酶解過夜，最后加入10 μL甲酸混勻以終止反應(yīng)。酶解液于13 000×g離心10 min，取500 μL上清液于10 kDa超濾管中，14 000×g離心20 min，再取200 μL濾液于樣品瓶中待測。

1.3.3 設(shè)備參數(shù)

1.3.3.1 Easy-nLC 1000-Q Exactive測定條件

色譜條件：富集柱：C18毛細色譜柱（100 μm×4 cm，5 μm，120 ?）；分析柱：C18毛細色譜柱（75 μm×15 cm，5 μm，120 ?）；流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈；洗脫程序：0～3 min，97%～93% A，3%～7% B；3～38 min，93%～78% A，7%～22% B；38～48 min，78%～65% A，22%～35% B；48～50 min，65%～10% A，35%～90% B；50～60 min，10% A，90% B；流速300 nL/min；進樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件：電離源為電噴霧（正離子）離子源；掃描模式為Full MS/dd-MS2；全掃描分辨率70 000，AGC target為1×106，掃描范圍m/z350～1 800；dd-MS2分辨率17 500，AGC target為1×105，隔離窗口為m/z2.0，F(xiàn)ixed first mass為m/z120.0，碰撞能為27 eV。Thermo Proteome Discoverer 1.4軟件相關(guān)參數(shù)：蛋白數(shù)據(jù)庫（bovine）從Uniprot數(shù)據(jù)庫進行下載（http://www.uniprot.org）；MS1質(zhì)量范圍350～5 000 Da；最小峰數(shù)為1；水解酶為胰蛋白酶；允許漏切位點最多為2；肽段長度6～144；母離子質(zhì)量誤差±10-6Da；碎片離子質(zhì)量誤差±0.02 Da。

1.3.3.2 UPLC-Triple Quad 6500＋測定條件

色譜條件：色譜柱：Proteonavi（2.0 mm×150 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈；洗脫程序：0～2 min，90% A，10% B；2～5 min，90%～80% A，10%～20% B；5～9 min，80%～78% A，20%～22% B；9～13 min，78%～70% A，22%～30% B；13～18 min，70%～25% A，30%～75% B；18～22 min，25% A，75% B；22～22.01 min，25%～90% A，75%～10% B；22.01～25 min，90% A，10% B；流速300 μL/min；進樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（正離子）；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子化電壓5 500 V；霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力55 psi；氣簾氣壓力30 psi；離子源溫度500 ℃。

1.3.4 方法學(xué)驗證

1.3.4.1 線性、LOD和LOQ

選擇面粉作為空白基質(zhì)，向其中加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲備液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使其理論蛋白系列質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000、30 000 ng/mL。以特征肽段的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）得到線性回歸方程。在空白基質(zhì)中，添加標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲備液，獲得定量特征肽段信噪比為3時，作為其對應(yīng)過敏原蛋白的檢出限（limit of detection，LOD）；定量特征肽段信噪比為10時，作為其對應(yīng)過敏原蛋白的LOQ，以μg/g表示。

1.3.4.2 基質(zhì)效應(yīng)

分別精密移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲備液，用水稀釋配制，使其理論蛋白系列質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000、30 000 ng/mL。

基質(zhì)效應(yīng)按下式計算：

式中：slopematrix為空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；slopestandard為水溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.3.4.3 加標(biāo)回收率與精密度

向空白基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲備液進行回收率測定，β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白的具體添加量為25、100、500、5 000 ng/mL，每個質(zhì)量濃度設(shè)置6 個平行實驗，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）以評估方法精密度。為排除基質(zhì)對3 種過敏原蛋白定量產(chǎn)生的影響，標(biāo)準(zhǔn)曲線均采用添加標(biāo)準(zhǔn)蛋白的空白基質(zhì)酶解液進行配制。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

回歸方程及相關(guān)系數(shù)采用MultiQuant 3.0.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算得出；色譜圖即為Analyst軟件原始提取離子流圖；采用Excel進行數(shù)據(jù)計算及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征肽段的篩選

牛奶中包括3.5%的蛋白質(zhì)，主要分為兩大類：約占總蛋白質(zhì)80%的酪蛋白和占20%的乳清蛋白[21]，其中含量豐富的α-酪蛋白（αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白）和β-乳球蛋白被認為牛奶的主要過敏原成分[24,29]。且研究數(shù)據(jù)表明，IgE介導(dǎo)的牛奶過敏中60%的病人是對β-乳球蛋白過敏[30]，因此本實驗選擇β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白作為牛奶過敏原檢測的研究對象，其氨基酸序列見圖1。

圖1 β-乳球蛋白（A）、αs1-酪蛋白（B）和αs2-酪蛋白（C）氨基酸序列Fig. 1 Amino acid sequences of β-lactoglobulin (A), αs1-casein (B) and αs2-casein (C)

表1 牛奶過敏原鑒定所得全部肽段信息Table 1 Information about all peptides derived from milk allergens

β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)胰蛋白酶酶解后，采用Easy-nLC 1000-Q Exactive進行分析。結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫，將所得譜圖信息利用Thermo Proteome Discoverer 1.4軟件鑒定匹配。經(jīng)數(shù)據(jù)分析后，3 種標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解液所得肽段信息見表1，β-乳球蛋白8 條肽段，肽段覆蓋率為40.4%；αs1-酪蛋白12 條，肽段覆蓋率為51.9%；αs2-酪蛋白13 條肽段，肽段覆蓋率為56.3%。然后根據(jù)以下特征肽段的篩選原則篩選特征肽段：肽段長度以7～20 個氨基酸為宜，肽段長度少于7 個氨基酸很難滿足其特異性，而長度過長不僅在實驗過程中易于斷裂且合成價格昂貴[26]；不含漏切或錯切的酶切位點，以保證肽段良好的可重復(fù)性；最好不含甲硫氨酸，因其易被氧化修飾[28]；進行定性定量分析時，具有較好的靈敏度和峰形[31-33]；經(jīng)BLAST搜索后具有特異性。最終篩得8 條特征肽段，他們分別是β-乳球蛋白的VLVLDTDYK和TPEVDDEALEK；αs1-酪蛋白的FFVAPFPEVFGK、HQGLPQEVLNENLLR和YLGYLEQLLR；αs2-酪蛋白的NAVPITPTLNR、FALPQYLK和TVYQHQK。

2.2 反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)優(yōu)化

將8 條特征肽段混標(biāo)儲備液用水稀釋至5 000 ng/mL，通過蠕動泵以5 μL/min的速率直接注入Triple Quad 6500＋質(zhì)譜儀中，通過全掃描模式確定特征肽段的前體離子精確質(zhì)量數(shù)，再通過產(chǎn)物離子掃描從產(chǎn)物離子中選擇2 個穩(wěn)定且靈敏度高的特征子離子，以建立MRM離子對。在MRM模式下優(yōu)化各特征肽段的去簇電壓和碰撞能，見表2、圖2。根據(jù)各肽段靈敏度的高低，分別將VLVLDTDYK、FFVAPFPEVFGK和NAVPITPTLNR作為β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白的定量肽段。

表2 牛奶過敏原特征肽段的MRM參數(shù)Table 2 MRM parameters of signature peptides derived from milk allergens

圖2 牛奶過敏原8 條特征肽段的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of eight signature peptides derived from milk allergens

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性關(guān)系和基質(zhì)效應(yīng)

表3 牛奶過敏原定量特征肽段的線性關(guān)系Table 3 Linear calibration equations for quantitative analysis of signature peptides derived from milk allergens

表4 3 種牛奶過敏原的LOD、LOQ和基質(zhì)效應(yīng)Table 4 LODs, LOQs and matrix effects of three milk allergens

牛奶過敏原β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白在面粉基質(zhì)中的線性關(guān)系見表3，其在1.6～30 000 ng/mL的線性范圍內(nèi)線性良好，R2均大于0.999。由表4可知，β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白LOQ分別為50、3.2 μg/g和40 μg/g。此外，由表4可得β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白在面粉基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)分別為90.54%、86.04%和97.48%，均有不同程度的離子減弱作用，但并不明顯，均在20%以內(nèi)，后續(xù)實驗均采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線補償基質(zhì)效應(yīng)。

傳統(tǒng)ELISA線性范圍窄，故實際樣品需要稀釋后再進行定量，但Monaci等[34]研究表明稀釋對ELISA法定量牛奶過敏原有顯著影響，此外Koeberl等[35]選取3 種市售ELISA試劑盒檢測羽扇豆，結(jié)果表明陽性樣品的假陰性率為50%、12.5%和33.3%，陰性樣品的假陽性率為33.3%、16.6%和25%，證明ELISA檢測方法的交叉反應(yīng)及不準(zhǔn)確性。PCR技術(shù)從DNA水平可有效解決復(fù)雜基質(zhì)中帶來的檢測困難，但Villa等[15]研究基于β-乳球蛋白基因分別采用定性PCR和實時PCR檢測肉制品中牛奶過敏原，結(jié)果缺乏可重復(fù)性，LOD高達500 μg/g；賈敏等[17]基于GenBank基因建立實時定量PCR法檢測α-乳白蛋白，液體樣品LOD為1 000 copies/mL，但在實際樣品果粒奶優(yōu)中無擴增曲線，尚不滿足痕量檢測。與此同時，以上方法均未涉及多重過敏原的同時檢測，而基于質(zhì)譜技術(shù)的檢測方法，從特異性的肽段水平進行定量，準(zhǔn)確性和靈敏度更高，但目前仍大多局限于單一牛奶過敏原的定量檢測，如Lamberti等[4]檢測餅干中的αs1-酪蛋白，LOQ為4 μg/g；Lai Shiyun等[27]檢測奶制品中的α-乳白蛋白，LOQ為50 μg/g。而本方法可以有效同時定量3 種牛奶過敏原，三者可以相互輔助定性牛奶成分的存在，LOQ最低為3.2 μg/g，可以對食品中的痕量牛奶過敏原進行檢測。

2.3.2 加標(biāo)回收率與精密度結(jié)果

表5 牛奶過敏原的加標(biāo)回收率和RSD（n=6）Table 5 Recoveries and RSDs of milk allergens from spiked samples (n= 6)

由表5可知，β-乳球蛋白的平均回收率在86.41%～97.59%之間，RSD不大于4.96%；αs1-酪蛋白的平均回收率在87.34%～98.60%之間，RSD不大于4.31%；αs2-酪蛋白的平均回收率在86.98%～92.76%之間，RSD不大于8.95%。相比于Qi Kailun等[36]采用LC-MS法在空白焙烤食物基質(zhì)中αs1-酪蛋白平均回收率在65.2%～71.5%之間，αs2-酪蛋白的平均回收率在79.6%～86.1%之間，可見本方法回收率更加穩(wěn)定，重復(fù)性高，可作為實際樣品的準(zhǔn)確定量檢測方法。

2.4 實際樣品檢測結(jié)果

為評估本實驗所建方法的實用性，從當(dāng)?shù)爻须S機選取8 種實際樣品進行檢測，其中薯片、奶茶粉、小洋人和早餐包標(biāo)簽信息中含有牛奶但無過敏原標(biāo)簽提示，沙琪瑪、蛋黃派、餅干和面粉標(biāo)簽信息中未標(biāo)明含有牛奶成分且無過敏原提示。如表6所示，標(biāo)簽信息中含有牛奶成分的4 個樣品均成功檢出β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白，含量范圍分別為（5.502×102±9.451）～（2.402×103±132.4）、（4.917×102±3.484）～（1.003×104±199.1） μg/g和（2.998×102±5.053）～（3.398×103±31.47） μg/g，而不含牛奶的4 個樣品中3 種過敏原均未檢出。雖然結(jié)果并未檢出產(chǎn)品中潛在的牛奶過敏原，但不同生產(chǎn)線間的交叉污染現(xiàn)象仍不容輕視，而本方法可有效保障消費者食品安全，為企業(yè)的自檢提供技術(shù)支持，使其可自行標(biāo)明其可能隱藏的過敏原成分，促進食品過敏原標(biāo)識市場監(jiān)管的進一步落實和強化。

表6 UPLC-MS/MS法檢測市售食品中牛奶過敏原含量Table 6 Contents of milk allergens in commercial foods determined by UPLC-MS/MS

3 結(jié) 論

基于β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白的特征肽段，建立UPLC-MS/MS方法，在MRM模式下可用于快速篩查和定量食品中的牛奶過敏原。本方法通過同時檢測3 種主要的牛奶過敏原判斷食品中牛奶的存在，避免單一致敏蛋白在加工中的降解及定量限等因素導(dǎo)致的假陰性，LOQ分別為β-乳球蛋白50 μg/g、αs1-酪蛋白3.2 μg/g、αs2-酪蛋白40 μg/g。方法學(xué)實驗證實了本方法良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，可為我國牛奶過敏原的標(biāo)簽標(biāo)識管理及定量檢測提供技術(shù)支持，還可為其他過敏原的高通量檢測提供理論基礎(chǔ)。