申進(jìn)玲，趙麗娜,*，韓 偉，許鎮(zhèn)堅(jiān)，蔣 原,,*，楊捷琳，郭德華，薛 峰

（1.上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

副溶血性弧菌是全球范圍內(nèi)引起水產(chǎn)類食物中毒的首要病原菌，尤其在中國(guó)、日本在內(nèi)的亞洲國(guó)家和美國(guó)等地區(qū)。副溶血性弧菌在美國(guó)每年引起約8萬(wàn) 例疾病以及100 人死亡[1]，中國(guó)臺(tái)灣、日本和東南亞近50%的食物中毒事件是由副溶血性弧菌引起[2]。副溶血性弧菌可在水生動(dòng)物的腸道內(nèi)黏附、聚集和繁殖，引發(fā)水生動(dòng)物疾病，給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失，亦可引起人類胃腸炎等疾病，嚴(yán)重者可引發(fā)傷口感染和敗血癥等[3]。溶血素是副溶血性弧菌最主要致病因子，包括不耐熱溶血素（thermolabile hemolysin，TLH）、直接耐熱溶血素（thermostable direct hemolysin，TDH）和TDH相關(guān)溶血素（TDH related hemolysin，TRH），分別由tlh、tdh和trh基因編碼。TLH在副溶血性弧菌中高度保守，TDH具有細(xì)胞毒性、致死毒性和腸毒性，而TRH具有腸毒性，致病性副溶血性弧菌通常攜帶TDH和TRH中的1 種或2 種。近年來(lái)隨著抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的濫用，細(xì)菌耐藥性問題更加劇了副溶血性弧菌的風(fēng)險(xiǎn)。上海口岸進(jìn)口水產(chǎn)品數(shù)量居全國(guó)第一，且樣品來(lái)自各個(gè)國(guó)家地區(qū)，種類豐富，代表性強(qiáng)。上海及其周邊沿海一帶對(duì)水產(chǎn)品的消費(fèi)量逐年遞增。進(jìn)口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的存在對(duì)我國(guó)食品安全和公共衛(wèi)生帶來(lái)極大威脅。研究我國(guó)進(jìn)口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的分布情況、耐藥性、毒力基因和遺傳多樣性，對(duì)保障我國(guó)人民生命安全和健康具有重大意義。因此本研究擬對(duì)不同國(guó)家進(jìn)口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌進(jìn)行耐藥、關(guān)鍵毒力基因和多位點(diǎn)序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）分析，旨在為進(jìn)口食品風(fēng)險(xiǎn)科學(xué)預(yù)警和溯源提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本研究所用68 株副溶血性弧菌菌株由2017—2019年上?？诎哆M(jìn)口的400 份水產(chǎn)品中分離，樣品來(lái)自全世界16 個(gè)國(guó)家（地區(qū)），樣品種類涵蓋魚、蝦、貝、蟹等常見海產(chǎn)品和淡水產(chǎn)品等（表1）。所有菌株經(jīng)生化和分子生物學(xué)鑒定確證為副溶血性弧菌。

表1 副溶血性弧菌菌株來(lái)源信息Table 1 Information about the sources of Vibrio parahaemolyticus isolates

藥敏實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922。分子生物學(xué)鑒定所用菌株為副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33847（tdh＋）和ATCC17802（trh＋）。所用質(zhì)控菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

弧菌顯色培養(yǎng)基 法國(guó)科瑪嘉公司；3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Mueller-Hinton瓊脂、藥敏紙片 英國(guó)Oxoid公司；實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）預(yù)混液、PCR預(yù)混液、DNA Marker DL2000 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。引物探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Vitek全自動(dòng)微生物生化鑒定儀（梅里埃）、ABI7500 fast實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；5415R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；ND-1000分光光度計(jì) 美國(guó)Nano-Drop科技公司；電泳槽、電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株純化與鑒定

使用無(wú)菌接種環(huán)，將菌株劃線接種至副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取紫色單菌落，再次劃線接種于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂上培養(yǎng)過夜。用一次性無(wú)菌接種環(huán)挑選適量菌落于3 mL無(wú)菌生理鹽水中充分混勻，制成麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌懸液，使用全自動(dòng)微生物生化鑒定儀進(jìn)行鑒定。

1.3.2 DNA模板制備

DNA制備方法采用煮沸裂解法。用無(wú)菌槍頭吸取500 μL 1.3.1節(jié)菌懸液于1.5 mL離心管中，100 ℃煮沸15 min后，冷卻至室溫，12 000×g離心2 min，取上清液備用。對(duì)符合生化實(shí)驗(yàn)的菌株采用PCR方法擴(kuò)增副溶血性弧菌特異的tlh基因[4]。

1.3.3 藥敏實(shí)驗(yàn)

采用WHO推薦的紙片擴(kuò)散法。共測(cè)試對(duì)8 類15 種抗生素的耐藥性。包括青霉素類：氨芐西林（ampicillin，AMP）、阿莫西林（amoxicillin，AMC）、哌拉西林（piperacillin，PRL）；青霉烯類：美羅培南（meropenem，MEM）、亞胺培南（imipenem，IPM）；頭孢類：頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）（第3代）、頭孢噻肟（cefotaxime，CTX）（第3代）、頭孢西?。╟efoxitin，F(xiàn)OX）（第2代）；氨基糖苷類：阿米卡星（amikacin，AK）、慶大霉素（gentamicin，CN）；氟喹諾酮類：環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）；氯霉素類：氯霉素（chloramphenicol，C）；四環(huán)素類：四環(huán)素（tetracycline，TE）；磺胺類：磺胺新諾明（sulfamethoxazole，SXT）。依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)判定藥敏結(jié)果[5]。以大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。

1.3.4 毒力基因檢測(cè)

副溶血性弧菌關(guān)鍵毒力基因tdh和trh檢測(cè)所用引物探針、real-time PCR體系和條件按照文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行[4,6]。

1.3.5 MLST分析

表2 副溶血性弧菌MLST PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物信息Table 2 Amplification and sequencing primers used in multi-locus sequence typing analysis of V. parahaemolyticus isolates

副溶血性弧菌的7 個(gè)管家基因recA、gyrB、dnaE、dtdS、pntA、pyrC、tnaA引物、PCR體系和反應(yīng)條件參考網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubmlst.org/vparahaemolyticus/info/protocol.shtml），PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物序列見表2。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。采用Bioedit軟件對(duì)分離株的每段基因序列與從MLST網(wǎng)站下載的參考菌株序列進(jìn)行比對(duì)，將分離株的基因序列剪切后得到與參考菌株基因相同大小的片段。將經(jīng)過剪切的每株菌的7 個(gè)基因序列按照相同的順序首尾相接，得到3 961 bp的長(zhǎng)片段。將所有菌株的3 961 bp片段導(dǎo)入至MEGA 6.06軟件，采用UPGMA方法生成系統(tǒng)發(fā)育樹圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥結(jié)果分析

表3 68 株副溶血性弧菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Antimicrobial resistance of 68 V. parahaemolyticus isolates

如表3所示，68 株菌株對(duì)LEV和C均敏感，對(duì)其余抗生素不同程度地耐藥，耐藥率最高的是AMP，達(dá)98.53%，其次是AK（8.82%）、CN（5.88%）、PRL（5.88%）、MEM（4.41%）、SXT（4.41%）。對(duì)AMC、IPM、CAZ、FOX的耐藥率較低，均為1.47%。同時(shí)，對(duì)9 種抗生素中介耐藥，其中氨基糖苷類抗生素中介耐藥率最高，分別達(dá)45.59%（AK）、36.76%（CN）。其他中介耐藥率較高的抗生素依次為29.41%（PRL）、20.59%（CIP）、10.29%（FOX），其余抗生素中介耐藥率相對(duì)較低（1%～3%）。不同地區(qū)和產(chǎn)品來(lái)源的菌株耐藥情況未發(fā)現(xiàn)有明顯差異。

如表4可知，79.41%的菌株表現(xiàn)出單一耐藥，AMP是主要的耐藥譜，耐受2 種及以上的菌株占20.59%，其中耐受2 種抗生素的耐藥譜較分散，占比14.71%，有4 株耐3 種及以上抗生素，耐藥譜分別為AMP-AK-CN（加拿大鰲蝦F21），AMP-AK-CN-PRL（美國(guó)珍寶蟹F14、孟加拉黑蟹F43），AMP-CAZ-SXT-FOX-AMC-PRL-MEM（愛爾蘭面包蟹F64），同時(shí)它們也均表現(xiàn)出對(duì)2 種抗生素的中介耐藥。38.24%表現(xiàn)為單一中介耐譜，對(duì)2 種抗生素中介耐藥的占25.00%，14.71%的菌株表現(xiàn)對(duì)3 種及以上的抗生素中介耐藥。

表4 68 株副溶血性弧菌耐藥譜和中介譜分布Table 4 Resistance and intermediate resistance spectrum distribution of 68 V. parahaemolyticus isolates

2.2 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

所有副溶血性弧菌均為tlh陽(yáng)性。只有來(lái)自印度黑蟹的1 株菌株（F108，未知ST型）檢出trh陽(yáng)性，其余均為陰性，檢出率為1.47%（1/68）。所有菌株tdh檢測(cè)結(jié)果為陰性。

2.3 MLST分析

MLST分析結(jié)果顯示所測(cè)試的菌株具有高度遺傳多樣性。68 株菌株共發(fā)現(xiàn)65 種ST型，經(jīng)與pubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)比較，只有13 種是已知報(bào)道的ST型，分別是ST163、ST423、ST150、ST338、ST340、ST744、ST500、ST2192、ST490、ST338、ST154、ST12、ST424。其余52 種ST型是新發(fā)現(xiàn)的，新ST型高達(dá)80%。52 種新發(fā)現(xiàn)的ST型中，35 株由于一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)基因突變，不能與pubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)完全匹配。

圖1 不同國(guó)家不同食品類型來(lái)源副溶血性弧菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of V. parahaemolytics isolates from various types of food imported from different countries

除了2 株recA不能擴(kuò)增，其余66 株的親緣關(guān)系見圖1。副溶血性弧菌高度多樣化，分別來(lái)自菲律賓和印度尼西亞青蟹中的2 株與其他菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。剩余的菌株中，除了越南草蝦中1 株（CXF3）和加拿大珍寶蟹1 株（F62），其余菌株可以分為2 簇：Ia和Ib。5 株歐洲（愛爾蘭、荷蘭、英國(guó)）來(lái)源的菌株中，4 株位于Ib；5 株來(lái)自莫桑比克青蟹的菌株中4 株位于Ia。未發(fā)現(xiàn)其他國(guó)家（地區(qū)）來(lái)源的菌株明顯的聚類，如加拿大和美國(guó)珍寶蟹、越南草蝦、印度尼西亞和菲律賓的青蟹、印度黑蟹分布均較分散。但發(fā)現(xiàn)某些從同一地區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)境的相同食品類型中的菌株ST型一致或非常接近，且這些ST型未在其他地區(qū)出現(xiàn)。如F103和F134均來(lái)自加拿大的珍寶蟹，但時(shí)間相隔1 個(gè)月，分別在2019年3月20日和4月16日進(jìn)境，同屬于一個(gè)未知的ST型；F58和F121均來(lái)自莫桑比克的青蟹，分別于2019年2月25日和4月8日進(jìn)境，同屬于ST338；F18（ST 163）和F79分別來(lái)自2018年12月印度尼西亞青蟹和2019年3月馬來(lái)西亞青蟹，ST型只存在1 個(gè)堿基差異。

3 討論和結(jié)論

弧菌一般對(duì)人用和獸用的抗生素敏感，但隨著抗生素在人類、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)系統(tǒng)的濫用，副溶血性弧菌也表現(xiàn)出對(duì)多種抗生素的耐藥。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，副溶血性弧菌對(duì)AMP具有較高的耐藥率，本研究測(cè)定的副溶血性弧菌對(duì)AMP的耐藥率達(dá)98.53%，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致[7-10]。Elmahdi等[11]通過分析不同國(guó)家的副溶血性弧菌耐藥譜，發(fā)現(xiàn)最常耐藥的抗生素為AMP、盤尼西林和TE。本研究尚未發(fā)現(xiàn)TE耐藥，但發(fā)現(xiàn)近3%菌株對(duì)TE中介耐藥。值得注意的是，本研究菌株表現(xiàn)出對(duì)多種抗生素的中介耐藥，其中氨基糖苷類抗生素中介耐藥情況最突出，另外PRL、CIP和FOX中介耐藥率也達(dá)到10%～30%，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致[7,12-17]。中介耐藥說(shuō)明菌株正在適應(yīng)抗生素，需要引起重視。據(jù)報(bào)道，近年來(lái)副溶血性弧菌逐漸出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象[15,18-20]，本研究也發(fā)現(xiàn)上海口岸進(jìn)口水產(chǎn)品中20.59%的菌株表現(xiàn)出對(duì)2 種及以上的抗生素耐藥。值得注意的是，深海水產(chǎn)品中副溶血性弧菌也發(fā)現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，說(shuō)明抗生素耐藥已經(jīng)延伸到深海區(qū)域，今后應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注深海水產(chǎn)品中致病菌的耐藥情況。

分子流行病學(xué)表明攜帶tdh和trh基因的副溶血性弧菌產(chǎn)毒株與人類食源性疾病的爆發(fā)密切相關(guān)，它們?cè)谂R床菌株中檢出率高，而在環(huán)境和食品中檢出率很低[2,4,21]。于紀(jì)棉等[12]報(bào)道寧波口岸進(jìn)口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的tdh和trh攜帶率分別為0.78%和0%，陳廣全等[22]報(bào)道北京口岸進(jìn)口鮮活海產(chǎn)品中副溶血性弧菌tdh和trh攜帶率均為5%，李薇薇等[23]報(bào)道我國(guó)國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)18 個(gè)省、自治區(qū)、直轄市水產(chǎn)品中副溶血性弧菌tdh和trh攜帶率分別為0%和2.08%，白瑤等[8]報(bào)道我國(guó)26 個(gè)省、直轄市和自治區(qū)水產(chǎn)品中分離的1 137 株副溶血性弧菌中tdh和trh檢出率分別為0.3%和1.7%。本研究也發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)品中副溶血性弧菌trh和tdh攜帶率極低，與以往報(bào)道相符[7,24-25]。因此，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)和進(jìn)口水產(chǎn)品中均存在致病性副溶血性弧菌，對(duì)我國(guó)人民健康帶來(lái)隱患，日后需要加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。

本研究測(cè)試的水產(chǎn)品中副溶血性弧菌菌株呈現(xiàn)高度的遺傳多樣性，與以往研究結(jié)果一致[26-28]。經(jīng)pubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，本研究發(fā)現(xiàn)的ST型中，ST338、ST340、ST774均在臨床中報(bào)道過，因此這些菌株可能具有致病風(fēng)險(xiǎn)。65 種發(fā)現(xiàn)的ST型中，新發(fā)現(xiàn)的有52 種。新型如此之多，可能是由于副溶血性弧菌基因組通過突變和重組一直在改變[26,29]。有研究表明，副溶血性弧菌基因組高度重組，被稱為半克?。╯emi clonal）群體[30]。由于基因和基因簇在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)或較近的菌株間傳播，因此基于MLST的分型分析較難找到與地域或食品類型高度相關(guān)的克隆株[8,17,26]。白瑤等[8]對(duì)我國(guó)水產(chǎn)品中20 株tdh和（或）trh陽(yáng)性的副溶血性弧菌PFGE分析結(jié)果也顯示，PFGE型別與耐藥譜、地域來(lái)源以及食品類別均無(wú)明顯關(guān)系，但來(lái)自河北省的5 株同源性較高。Urmersbach等[26]對(duì)來(lái)自斯里蘭卡、厄瓜多爾、北海、波羅的海和德國(guó)環(huán)境和水產(chǎn)品中副溶血性弧菌MLST分析，也未發(fā)現(xiàn)ST型與地域之間有明顯關(guān)系。本研究基于MLST分析的系統(tǒng)發(fā)育樹圖顯示，國(guó)家（地區(qū)）、食品類別與MLST型和耐藥性并無(wú)明顯相關(guān)性，但發(fā)現(xiàn)某些地區(qū)來(lái)源的菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹圖上呈現(xiàn)局部聚集，另外也發(fā)現(xiàn)某些ST型分別在相隔數(shù)月的時(shí)間在來(lái)自于同一國(guó)家同一食品中出現(xiàn)。這說(shuō)明，在這些國(guó)家可能出現(xiàn)了新的流行克隆株，同時(shí)也說(shuō)明MLST分析在副溶血性弧菌流行病學(xué)研究中可以監(jiān)測(cè)并跟蹤新的流行克隆，實(shí)現(xiàn)早期預(yù)警。

有研究報(bào)道recA基因存在重組導(dǎo)致的大量位點(diǎn)突變，因此有學(xué)者提出recA不是MLST中的理想位點(diǎn)[31]。本研究也發(fā)現(xiàn)在68 株菌株的7 個(gè)基因中，recA基因差異性最大，與pubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)相比，2 株具有多個(gè)位點(diǎn)突變，其他基因突變位點(diǎn)一般為1 個(gè)（結(jié)果未顯示），另外還有2 株經(jīng)過多次PCR未能擴(kuò)增成功。已有不少報(bào)道證實(shí)，recA擴(kuò)增不成功是有大片段插入recA基因位點(diǎn)所致，這種插入可對(duì)菌株的生物特性產(chǎn)生影響[32-33]。González-Escalona等[32]發(fā)現(xiàn)來(lái)自弧菌屬的長(zhǎng)片段插入秘魯糞便樣品中分離的副溶血性弧菌O4∶K8（菌株編號(hào)090-96）的recA中，后經(jīng)對(duì)原始recA基因重建分析發(fā)現(xiàn)，其祖先為僅在亞洲出現(xiàn)的ST189，證實(shí)了菌株的跨海洋傳播。Chen xiao等[33]在O4∶KUT中發(fā)現(xiàn)與菌株090-96同樣的插入片段，基因組分析提示該菌株從O4∶K8進(jìn)化而來(lái)，但插入片段的功能以及與K抗原之間的關(guān)系尚未可知。因此未來(lái)將對(duì)本研究中recA擴(kuò)增不正常的菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，以揭示插入片段在菌株進(jìn)化中的作用。

綜上所述，通過對(duì)上?？诎哆M(jìn)口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌進(jìn)行耐藥性、毒力基因和MLST分析，發(fā)現(xiàn)菌株存在中介耐藥和多重耐藥現(xiàn)象，尤其在深海水產(chǎn)品中也出現(xiàn)了多重耐藥；發(fā)現(xiàn)某些ST型在臨床中報(bào)道過，篩選到攜帶毒力基因的高致病性菌株，這些均具有高風(fēng)險(xiǎn)；發(fā)現(xiàn)某些國(guó)家可能存在新的流行克隆。這些均需要引起重視，并在今后工作中持續(xù)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，以期為我國(guó)進(jìn)口食品風(fēng)險(xiǎn)因子科學(xué)預(yù)警和溯源提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。