王 偉，李津津，遲 海,

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

近年來抗生素長期的濫用促使細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致耐藥性致病菌的檢出頻率增加。耐藥性致病菌的傳播給人類健康帶來了一定威脅[1-2]。同時(shí)，食源性致病菌污染和繁殖是造成食品安全隱患的首要問題之一[3]。全球因誤食污染食源性致病菌食物而引發(fā)的中毒現(xiàn)象普遍存在[4-5]。添加化學(xué)食品抑菌劑是抑制食源性致病菌生長的有效手段之一，然而化學(xué)抑菌劑對人體的潛在危害成為消費(fèi)者日益擔(dān)憂的食品安全問題。細(xì)菌素是細(xì)菌核糖體編碼合成的一類對親緣微生物具有高效抑制作用的抑菌肽或前體多肽[6]。由于細(xì)菌素具有綠色、無殘留、安全、高效的特點(diǎn)，目前已成為抗生素和化學(xué)抑菌劑替代品的極佳選擇之一[7-8]。然而目前只有乳酸鏈球菌素（Nisin）通過美國食品藥品監(jiān)督管理局/世界衛(wèi)生組織認(rèn)證并允許在食品中應(yīng)用，主要原因是其他細(xì)菌素大多存在抑菌譜窄和抑菌機(jī)理不明確兩方面的局限性[9-11]。因此篩選、鑒定具有廣譜抑菌性的細(xì)菌素并對其抑菌機(jī)理進(jìn)行研究對細(xì)菌素的應(yīng)用推廣具有重大意義。

芽孢桿菌（Bacillussp.）作為動植物和微生態(tài)的優(yōu)勢菌廣泛存在于自然界中[12-16]。其中解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）能夠產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)可以有效抑制多種病原微生物的生長，具有良好的研究和應(yīng)用價(jià)值[17-21]。本研究基于前期篩選所得到的一株解淀粉芽孢桿菌DH8030（B.amyloliquefaciensDH8030），通過對其產(chǎn)生的具有廣譜抑菌效應(yīng)的細(xì)菌素（命名為Amylocyclicin W5）進(jìn)行系統(tǒng)純化，估測了該細(xì)菌素分子質(zhì)量；同時(shí)通過抑菌能力分析、掃描電子顯微鏡以及透射電子顯微鏡觀察3 個(gè)方面對Amylocyclicin W5的抑菌機(jī)理進(jìn)行了探究，旨在為新型廣譜細(xì)菌素的開發(fā)利用及其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

指示菌蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）LMGT2805、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）LMGT3263[22]、腸出血性大腸桿菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）DH8013[23]和產(chǎn)細(xì)菌素的解淀粉芽孢桿菌DH8030（B.amyloliquefaciensDH8030）均由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所提供。

Nisin 北京蕾創(chuàng)生物科技有限公司；腦心浸出液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基 英國OXIOD公司；瓊脂粉 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；硫酸銨、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 6.8）、透析袋 國藥（上海）化學(xué)試劑有限公司；0.22 μm聚偏氟乙烯濾膜、0.45 μm聚偏氟乙烯濾膜上海生工生物工程股份有限公司；ExBlue蛋白超快染色液北京莊盟國際生物基因科技有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、乙腈 美國Sigma公司；氯化鈉 北京華奧寶生科技有限公司；三羥甲基-甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠制備試劑盒、超低分子質(zhì)量蛋白Marker（3.3～31.0 kDa）、1×三羥甲基-甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳緩沖液、2×三羥甲基-甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Power Wave XS微孔板掃描分光光度計(jì) 美國BIO-TEK有限公司；SEX-TJ超凈工作臺 上海生叉儀器有限公司；YXQ-LS-50 SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CHA-S恒溫振蕩器 國華電器有限公司；CF 16RXII低溫離心機(jī)、SU8010高分辨冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡、ES-2030型冷凍干燥儀日本日立有限公司；?KTA蛋白純化系統(tǒng) 通用電氣（中國）醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部。

1.3 方法

1.3.1 最低半抑菌濃度確定

將過夜培養(yǎng)的B.amyloliquefaciensDH8030菌液按1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種到400 mL的BHI液體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)至少12 h。發(fā)酵液于12 000 r/min、4 ℃條件下離心30 min，收集上清液并用0.22 μm的濾膜過濾。按照Chi Hai等的方法[24]，利用96 孔板二倍稀釋法測定Amylocyclicin W5發(fā)酵上清液和Nisin（質(zhì)量濃度為10 mg/mL）分別對B.cereusLMGT2805、MRSA LMGT3263以及E.coliO157:H7 DH8013的最低半抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC50）。其中，細(xì)菌素的抑菌單位（bacteriocin unit，BU）被定義為抑制200 μL條件下50%指示菌（B.cereusLMGT2805）菌量（OD600nm≈0.20～0.25）所需要Amylocyclicin W5最少的體積[24]。不同稀釋倍數(shù)的細(xì)菌素Amylocyclicin W5抑制指示菌所需體積越少，即對應(yīng)的抑菌孔數(shù)越多，抑菌效果越明顯。

1.3.2 硫酸銨沉淀初步純化

將制備好的Amylocyclicin W5發(fā)酵上清液平均分裝成8 份，每份50 mL；將硫酸銨分別添加至每份上清液中至不同的硫酸銨飽和度（10%～80%）[25]。待硫酸銨完全溶解后，于4 ℃條件下靜置過夜后10 000 r/min離心25 min，取上清液作為粗提物。對得到的粗提物分別進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)并對抑菌效果最好的粗提物進(jìn)行透析。利用截留分子質(zhì)量為8.0～14.0 kDa的透析袋，以體積分?jǐn)?shù)0.1%的TFA為透析液對該粗提物進(jìn)行反復(fù)透析，透析5 次后的粗提物置于-20 ℃冰箱備用并利用96 孔板二倍稀釋法測定抑菌活性。

1.3.3 離子交換分離純化

將10 mL細(xì)菌素粗提物經(jīng)恒流泵以5 mL/min的流速加入至Hiprep SP XL 16/10離子交換柱。當(dāng)粗提物全部加入完畢后，用2～3 倍細(xì)菌素體積的PBS進(jìn)行洗脫平衡，然后分別使用0.5 mol/L和1 mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫。收集每一步所得的洗脫液，利用1.3.1節(jié)的方法測定抑菌活性。

1.3.4 ?KTA蛋白純化系統(tǒng)純化

參考Halimi等[26]方法，在?KTA蛋白純化系統(tǒng)中使用C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm）對細(xì)菌素進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，并對分離純化后的細(xì)菌素進(jìn)行冷凍干燥，同時(shí)采用抑菌圈實(shí)驗(yàn)確定抑菌活性：將不同純化組分用高純水溶解，取2 μL點(diǎn)于BHI培養(yǎng)基觀察抑菌圈。

1.3.5 三羥甲基-甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考Sch?gger等[27]的方法，將凍干濃縮好的細(xì)菌素提純物質(zhì)進(jìn)行三羥甲基-甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。其中濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，夾層膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.5%。采用分子質(zhì)量3.3～31.0 kDa的Marker作為標(biāo)準(zhǔn)參照。電泳結(jié)束后使用ExBlue蛋白超快染色液對膠進(jìn)行染色和脫色，在Bio-Rad成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察分析。

1.3.6 Amylocyclicin W5對B.cereusLMGT2805的抑菌實(shí)驗(yàn)

以過夜培養(yǎng)的B.cereusLMGT2805為指示菌，采用96 孔板微量測定法測定不同倍數(shù)最低半抑菌濃度（MIC50、2 MIC50和4 MIC50）Amylocyclicin W5在12 h內(nèi)對B.cereusLMGT2805的抑菌情況。每隔0.5 h測定一組OD600nm。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD600nm為縱坐標(biāo)繪制B.cereusLMGT2805的生長曲線。

1.3.7 掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察

將1 L過夜培養(yǎng)的B.cereusLMGT2805菌液平均分成4 份，分別在3 500 r/min、4 ℃下離心15 min，棄上清液收集沉淀，得到B.cereusLMGT2805的營養(yǎng)型菌體；取兩份沉淀分別與體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液等體積混合后靜置1 h，3 500 r/min、4 ℃下離心15 min，棄上清液，收集沉淀得到B.cereusLMGT2805的芽孢型菌體[28]。等體積的細(xì)菌素Amylocyclicin W5發(fā)酵上清液分別與營養(yǎng)型和芽孢型菌體混合作為實(shí)驗(yàn)組，未經(jīng)過細(xì)菌素Amylocyclicin W5發(fā)酵上清液處理的營養(yǎng)型和芽孢型菌體作為對照組。將對照組和實(shí)驗(yàn)組置于30 ℃搖床中培養(yǎng)4 h后，分別在3 500 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清液收集沉淀。參考高明明[29]的方法將樣品置于固定液中進(jìn)行樣品制備，并參考Lee等[30]的方法，分別對對照組和實(shí)驗(yàn)組的B.cereusLMGT2805進(jìn)行掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Amylocyclicin W5的抑菌活性

表1為Amylocyclicin W5及Nisin的抑菌活性比較，結(jié)果顯示，Amylocyclicin W5對B.cereusLMGT2805的MIC50為5 BU/mL，Nisin抑制同樣體積的B.cereusLMGT2805時(shí)其MIC50為1.6 μg/mL；抑制相同體積的MRSA LMGT3263時(shí)Amylocyclicin W5的MIC50為20 BU/mL，Nisin的MIC50為50 μg/mL；Amylocyclicin W5對E.coliO157:H7 DH8013有抑制作用（MIC50為1 280 BU/mL），而Nisin單獨(dú)作用時(shí)不能抑制E.coliO157:H7 DH8013。以上結(jié)果表明，Amylocyclicin W5不僅可以抑制革蘭氏陽性菌B.cereus和MRSA，還可以對革蘭氏陰性菌E.coliO157:H7產(chǎn)生抑制作用。

表1 Amylocyclicin W5及Nisin的抑菌活性比較Table 1 Comparison of inhibition activity of amylocyclicin W5 and nisin

2.2 硫酸銨最佳飽和度的確定

發(fā)酵上清液經(jīng)不同飽和度硫酸銨沉淀得到的細(xì)菌素粗提物對B.cereusLMGT2805的抑菌活性見圖1，40%～60%飽和度硫酸銨沉淀的抑菌孔數(shù)呈增加趨勢，說明隨著硫酸銨飽和度的增加，發(fā)酵上清液中的抗菌蛋白的沉淀量也在增加；但抑菌孔數(shù)并未達(dá)到最大，說明還有部分抗菌蛋白沒有沉淀。當(dāng)硫酸銨飽和度為70%時(shí)，抑菌孔數(shù)增加至8時(shí)，達(dá)到最大抑菌孔數(shù)；但當(dāng)硫酸銨飽和度增加至80%時(shí)，抑菌孔數(shù)未見繼續(xù)增加，這說明硫酸銨飽和度為70%時(shí)抗菌蛋白基本已經(jīng)完全沉淀，當(dāng)飽和度進(jìn)一步增加時(shí)沉淀的可能是一些無抗菌活性的蛋白。因此，最適宜沉淀解淀粉芽孢桿菌素Amylocyclicin W5的硫酸銨飽和度為70%。

圖1 不同飽和度硫酸銨沉淀得到的細(xì)菌素粗提物的抑菌效果Fig.1 Antimicrobial activity of crude bacteriocin precipitated by different concentrations of ammonium sulfate

2.3 離子交換柱層析純化和?KTA蛋白純化系統(tǒng)分離純化結(jié)果

離子交換柱層析純化結(jié)果顯示，只有經(jīng)過0.5 mol/L NaCl洗脫后對應(yīng)的收集液對B.cereusLMGT2805具有抑菌效果。這說明0.5 mol/L NaCl可以很好地將吸附在HiPrep SP XL 16/10柱上的細(xì)菌素洗脫。圖2為經(jīng)過離子交換柱層析純化后的細(xì)菌素Amylocyclicin W5經(jīng)C18反向色譜柱及?KTA蛋白純化系統(tǒng)純化后的結(jié)果，細(xì)菌素Amylocyclicin W5經(jīng)流動相（純乙腈和體積分?jǐn)?shù)0.1%TFA-乙腈溶液）梯度洗脫后共有兩個(gè)峰（F1和F2）。其中只有組分F2對B.cereusLMGT2805有抑菌效果，因此收集F2對應(yīng)的洗脫液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 Amylocyclicin W5經(jīng)?KTA蛋白純化系統(tǒng)純化結(jié)果及對B.cereus LMGT2805 的抑菌活性Fig.2 Elution curve of amylocyclicin W5 using ?KTA purification system and inhibitory activity of separated fractions against B.cereus LMGT2805

2.4 細(xì)菌素Amylocyclicin W5純化物的三羥甲基-甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果

將純化后的細(xì)菌素Amylocyclicin W5進(jìn)行三羥甲基-甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果見圖3。細(xì)菌素Amylocyclicin W5經(jīng)過0.5 mol/L NaCl洗脫后得到的細(xì)菌素條帶不單一，表明純度較低，還存在較多的雜蛋白；進(jìn)一步利用C18反向色譜柱經(jīng)?KTA蛋白純化系統(tǒng)收集到的F2洗脫液在電泳后僅得到一條蛋白條帶，初步判斷出細(xì)菌素Amylocyclicin W5的分子質(zhì)量約為12.3 kDa。

圖3 細(xì)菌素純化物的三羥甲基-甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Tris-tricine-SDS-PAGE electrophoresis of bacteriocin purified products

2.5 Amylocyclicin W5對B. cereus LMGT2805生長的抑制情況

為探究細(xì)菌素Amylocyclicin W5對B.cereusLMGT2805的抑菌方式，分別測定了MIC50、2 MIC50、4 MIC50的細(xì)菌素Amylocyclicin W5在12 h內(nèi)對B.cereusLMGT2805的生長抑制曲線。由圖4可以看出，與未經(jīng)Amylocyclicin W5處理的B.cereusLMGT2805（對照組）相比，加入不同MIC50的Amylocyclicin W5對B.cereusLMGT2805生長均有抑制作用，而對照組的OD600nm則一直增加，直到達(dá)到穩(wěn)定期后趨于穩(wěn)定。對比加入MIC50、2 MIC50、4 MIC50細(xì)菌素的B.cereusLMGT2805生長曲線可知，MIC50、2 MIC50的細(xì)菌素分別在5、6.5 h內(nèi)有效地抑制了B.cereusLMGT2805的生長，其菌液的OD600nm均低于0.2；加入4 MIC50細(xì)菌素的B.cereusLMGT2805在12 h內(nèi)OD600nm一直低于0.1，未見B.cereusLMGT2805生長。由此可以看出，低濃度（MIC50和2 MIC50）細(xì)菌素Amylocyclicin W5在一定時(shí)間內(nèi)（分別為5、6.5 h）可有效抑制B.cereusLMGT2805的生長，高濃度（4 MIC50）細(xì)菌素Amylocyclicin W5則可以在12 h內(nèi)完全抑制B.cereusLMGT2805的生長。這一結(jié)果也說明當(dāng)細(xì)菌素Amylocyclicin W5的濃度大于4 MIC50時(shí)，其對B.cereusLMGT2805具有完全抑制作用。

圖4 不同濃度的Amylocyclicin W5對B.cereus LMGT2805的生長抑制曲線Fig.4 Growth curves of B.cereus LMGT2805 exposed to amylocyclicin W5 at different concentrations

2.6 Amylocyclicin W5作用后B. cereus LMGT2805在掃描電子顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)

Amylocyclicin W5作用4 h時(shí)在掃描電子顯微鏡下的B.cereusLMGT2805菌體細(xì)胞形態(tài)見圖5。對照組（圖5A1、B1）菌體細(xì)胞均呈均勻的桿狀，表面光滑、邊緣整齊、輪廓清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)十分完整；芽孢型的B.cereusLMGT2805經(jīng)細(xì)菌素Amylocyclicin W5處理后，菌體細(xì)胞邊緣粗糙、表面凹凸不平、褶皺明顯，已經(jīng)明顯開始破裂，營養(yǎng)型的B.cereusLMGT2805經(jīng)細(xì)菌素Amylocyclicin W5處理4 h后，細(xì)胞表面開始變得粗糙，細(xì)胞開始破裂，但不如細(xì)菌素Amylocyclicin W5對芽孢型B.cereusLMGT2805的菌體細(xì)胞表面形態(tài)破壞明顯。

圖5 Amylocyclicin W5作用前后的B.cereus LMGT2805掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果Fig.5 SEM photographs of B.cereus LMGT2805 treated with amylocyclicin W5

2.7 Amylocyclicin W5作用后B.cereus LMGT2805在透射電子顯微鏡下的內(nèi)部結(jié)構(gòu)

為了更加直觀地觀察細(xì)菌素Amylocyclicin W5對B.cereusLMGT2805的作用方式，利用透射電子顯微鏡觀察了B.cereusLMGT2805在Amylocyclicin W5作用后菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化（圖6）。在透射電子顯微鏡下對照組無論是芽孢型菌體（圖6A1、A2）還是營養(yǎng)型菌體的B.cereusLMGT2805（圖6B1、B2），其細(xì)胞內(nèi)容物飽滿、結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部原生質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密、無缺陷；實(shí)驗(yàn)組中則可以明顯地看出芽孢型菌體B.cereusLMGT2805被細(xì)菌素作用后，細(xì)胞壁膜界限模糊、破損且有孔洞出現(xiàn)（圖6A2），營養(yǎng)型狀態(tài)的B.cereusLMGT2805經(jīng)細(xì)菌素Amylocyclicin W5處理4 h后，觀察到菌體邊緣破裂，細(xì)胞破損嚴(yán)重以至膜結(jié)構(gòu)脫落，大量內(nèi)容物外泄使菌體細(xì)胞形成空泡化（圖6B2）。這些結(jié)果表明，細(xì)菌素Amylocyclicin W5對B.cereusLMGT2805的抑菌機(jī)制主要是破壞其細(xì)胞壁或者使其形成孔洞，造成其內(nèi)容物外泄，細(xì)胞正常代謝無法進(jìn)行，從而最終導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。

圖6 Amylocyclicin W5作用前后B.cereus LMGT2805透射電子顯微鏡觀察圖Fig.6 TEM photographs of B.cereus LMGT2805 treated with amylocyclicin W5

3 結(jié) 論

本研究通過對Amylocyclicin W5進(jìn)行一系列純化及鑒定，對其抑菌性質(zhì)及其抑菌機(jī)理進(jìn)行闡釋。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，最適宜沉淀發(fā)酵上清液中抗菌蛋白物質(zhì)的硫酸銨飽和度為70%；硫酸銨沉淀后的細(xì)菌素粗提物經(jīng)HiPrep SP XL 16/10柱層析分離純化，發(fā)現(xiàn)在0.5 mol/L NaCl條件下洗脫的收集液對B.cereusLMGT2805有抑菌活性；利用?KTA蛋白純化系統(tǒng)對收集液進(jìn)一步純化，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)收集峰（F1和F2）中只有F2組分對B.cereusLMGT2805有抑菌活性。因此，將收集峰F2對應(yīng)的洗脫液再次凍干后進(jìn)行三羥甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果顯示該細(xì)菌素的分子質(zhì)量約為12.3 kDa。

同時(shí)，本研究通過細(xì)菌素Amylocyclicin W5對B.cereusLMGT2805的生長抑制情況、細(xì)胞形態(tài)變化以及細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響3 個(gè)方面探討其抑菌機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高濃度（4 MIC50）條件下的Amylocyclicin W5可以在12 h內(nèi)完全抑制B.cereusLMGT2805的生長。通過掃描電子顯微鏡觀察和透射電子顯微鏡觀察，結(jié)果表明，細(xì)菌素Amylocyclicin W5對B.cereusLMGT2805的抑菌機(jī)制主要是破壞其細(xì)胞壁或者使其形成孔洞，使其內(nèi)容物外泄，細(xì)胞正常代謝無法進(jìn)行，從而最終導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。

對細(xì)菌素Amylocyclicin W5的純化以及抑菌機(jī)理的研究旨在為新型廣譜細(xì)菌素的開發(fā)利用及其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用研究提供數(shù)據(jù)支持。未來有望通過基因工程手段闡明其合成途徑，進(jìn)一步拓寬其抑菌譜，從而將其廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。