駱輝，陰文奇，高露茜，王雪濤，羅旭，廖果，李書偉，周遠(yuǎn)成*

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066；2.畜科生物工程有限公司，四川省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，四川成都 610200）

豬圓環(huán)病毒3 型（PCV3）是一種新型圓環(huán)病毒，2016 年首次在患有豬皮炎腎病綜合征（PDNS）與繁殖障礙的母豬及其流產(chǎn)胎兒體內(nèi)被鑒定發(fā)現(xiàn)［1］?；蚍治霭l(fā)現(xiàn)PCV3與PCV2、PCV1基因組之間的同源性較低，并且抗原蛋白Cap 之間不具有交叉保護(hù)性［2］。相關(guān)研究表明，PCV3已經(jīng)在我國(guó)出現(xiàn)并且流行了很長(zhǎng)一段時(shí)間［3］。PCV3 常以混合感染的形式出現(xiàn)，給養(yǎng)豬業(yè)的疾病防控帶來(lái)了一定困難，因此，快速準(zhǔn)確地診斷豬群的感染狀態(tài)對(duì)于預(yù)防和控制豬圓環(huán)病毒具有十分重要的意義。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)以其簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)在臨床上得到廣泛應(yīng)用。本研究通過設(shè)計(jì)針對(duì)PCV3 ORF2 的特異性引物，探索引物和探針最佳工作濃度，進(jìn)一步確定最適反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件，期望應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)建立定量檢測(cè)PCV3的方法。

1 試驗(yàn)材料

1.1 主要試劑及儀器設(shè)備 試劑：2×Premix Ex TaqTM、DL2000 DNA Marker，均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；病毒基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司。儀器：NanoDrop 2000（微量分光光度計(jì)，ThermoFisher Scientific）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（CFX Connect Real-Time system，BIO RAD）。

1.2 相關(guān)引物及探針 參照GenBank 中發(fā)表的PCV3 基因組序列，針對(duì)豬圓環(huán)病毒ORF2 保守區(qū)域，應(yīng)用生物信息軟件Primer Premier 5.0 分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和一條標(biāo)記FAM 熒光報(bào)告基團(tuán)的TaqMan MGB 探針，并送生工生物工程（上海）有限公司合成。引物和探針序列信息詳見表1。

表1 PCV3引物及探針序列信息

2 試驗(yàn)方法

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 參照DNA 試劑盒提取說(shuō)明書提取PCV3 陽(yáng)性病料DNA，并以其為模板用上述PCV3 引物進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)陽(yáng)性目的基因，回收純化PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物并克隆至pDC316 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取在氨芐青霉素抗性LB 平板上生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆，測(cè)序正確后提取質(zhì)粒。使用NanoDrop 2000 測(cè)定質(zhì)粒濃度，按以下公式計(jì)算拷貝數(shù)：拷貝數(shù)（拷貝/μL）＝（6.02×1023）×（質(zhì)粒濃度×10-9）/（DNA 長(zhǎng)度×660）。

2.2 引物和標(biāo)記探針最佳工作濃度的確定 將濃度為10 μmol/L的引物和探針，分別用ddH2O稀釋至終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L，以上述重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用矩陣法進(jìn)行熒光定量PCR 試驗(yàn)，篩選最適工作濃度，以獲得的最小Ct值及典型的S型擴(kuò)增曲線為判定依據(jù)。

2.3 酶最適添加量的確定 在引物和探針最佳工作濃度條件下，于擴(kuò)增體系中依次添加4、6、8、10、12 μL 酶量，進(jìn)行熒光定量PCR 試驗(yàn)，篩選酶最適添加量。

2.4 最佳退火延伸溫度的確定 在引物和探針最佳工作濃度以及最適酶添加量條件下，退火延伸溫度分別設(shè)置為55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃、61 ℃和62 ℃，進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，篩選最佳退火延伸溫度。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將PCV3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10 倍系列稀釋，選取7 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品模板，以確定的最適反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。以每反應(yīng)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸，循環(huán)閾值（Ct 值）為Y軸作回歸曲線，建立質(zhì)?？截悵舛扰c循環(huán)閾值對(duì)應(yīng)的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 特異性、敏感性及重復(fù)性試驗(yàn)

2.6.1 特異性試驗(yàn) 提取豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬偽狂犬病毒核酸，同時(shí)以PCV3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，按優(yōu)化的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行熒光定量PCR 試驗(yàn)，另設(shè)立空白對(duì)照，驗(yàn)證該檢測(cè)方法的特異性。

2.6.2 敏感性試驗(yàn) 將PCV3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作10倍系列稀釋，按照建立的PCV3 熒光定量PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR 方法檢測(cè)，比較兩者的敏感性。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 選取3個(gè)稀釋度重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，共檢測(cè)3次且每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行試驗(yàn)，對(duì)Ct 值結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并計(jì)算組間及組內(nèi)變異系數(shù)（CV），以驗(yàn)證所建立的熒光定量PCR方法的重復(fù)性。

2.7 對(duì)臨床樣品PCV3 的檢測(cè) 應(yīng)用本研究建立的熒光定量PCR 方法對(duì)2018～2020 年從四川省不同地區(qū)收集的329 份正常豬血清、56 份流產(chǎn)胎兒、29份精液、102份唾液拭子進(jìn)行PCV3檢測(cè)，通過PCV3 陽(yáng)性率了解目前四川省內(nèi)PCV3 的流行狀況。

3 結(jié)果

3.1 最佳反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件的確定 制備的PCV3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定濃度為311.1 ng/μL，換算成拷貝數(shù)是7.87×1010拷貝/μL。以PCV3重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR 試驗(yàn)，篩選出的最佳反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件結(jié)果見表2。檢測(cè)PCV3 所用引物及探針的最適終濃度均為0.5 μmol/L，反應(yīng)體系中酶最適添加量為12 μL，最優(yōu)擴(kuò)增條件為：95 ℃3 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，循環(huán)40次。

表2 熒光定量PCR檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)體系

3.2 PCV3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 不同稀釋度PCV3 標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為7.87×103～7.87×109拷貝/μL）的熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果見圖1，由此獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y＝-3.467 5x＋40.365，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 6，擴(kuò)增效率E為0.94（見圖2）。表明所設(shè)計(jì)的引物及探針的擴(kuò)增效率和結(jié)合率高，優(yōu)化的反應(yīng)條件適宜，可用于PCV3 核酸的定性和定量檢測(cè)。

3.3 特異性、敏感性及重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，除PCV3重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品外，其余樣品均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，表明本研究建立的熒光定量PCR 檢測(cè)方法的特異性良好。敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表3，熒光定量PCR 方法的最低檢測(cè)值為7.87×101拷貝/μL，而常規(guī)PCR方法最低檢測(cè)值為7.87×103拷貝/μL，表明本研究建立的PCV3 熒光定量PCR方法的敏感性優(yōu)于常規(guī)PCR方法，檢出率更高。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品模板的組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)為0.30%～0.81%，組間變異系數(shù)為0.39%～0.93%，可見PCV3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)的變異系數(shù)均小于1%（表4），表明該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性好。

圖1 不同稀釋度PCV3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 熒光定量PCR檢測(cè)PCV3的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 熒光定量PCR方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 臨床檢測(cè)結(jié)果 使用本研究建立的熒光定量PCR 方法對(duì)329 份正常豬血清進(jìn)行檢測(cè)，得出PCV3陽(yáng)性率為31.3%（103/329）。對(duì)56份流產(chǎn)胎兒、29 份精液、102 份唾液拭子進(jìn)行檢測(cè)，得出陽(yáng)性率分別為48.21%（27/56）、44.83%（13/29）、31.37%（32/102）。該結(jié)果表明PCV3 在四川省內(nèi)規(guī)?；i場(chǎng)廣泛存在，具有較高的流行率。

4 討論

PCV3 作為一種新型豬圓環(huán)病毒，自2016 年在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，陸續(xù)在中國(guó)、巴西、韓國(guó)等地區(qū)的豬場(chǎng)出現(xiàn)，如今在全世界范圍內(nèi)已呈流行趨勢(shì)。有學(xué)者表示PCV3 或可垂直傳播，且與PMWS、PDNS、母豬繁殖障礙以及增生性壞死性間質(zhì)性肺炎等疾病有關(guān)。值得注意的是，部分感染PCV3的豬只無(wú)臨床感染癥狀［4-5］。

本研究建立的熒光定量PCR 方法，特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高，最低檢測(cè)值為7.87×101拷貝/μL，靈敏度高于李暢等［6］得出的129 拷貝數(shù)。張志等［7］建立的PCV3 熒光定量PCR 方法的組內(nèi)及組間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)小于3%，而本試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于1%，可見本方法的重復(fù)性更好。目前PCV3 的病原學(xué)研究尚不明確，由于缺少適合PCV3繁殖的體外培養(yǎng)體系，對(duì)PCV3的分離培養(yǎng)比較困難，僅陳秋艷等［8］報(bào)道過通過PK15 細(xì)胞分離到PCV3 活毒株。后續(xù)可開展PCV3 的分離鑒定，為研究PCV3 的生物學(xué)特性、致病機(jī)制及疫苗研制等工作奠定基礎(chǔ)?！?/p>