李海燕，李紅梅，魏蔚，吳洋，王孟瑜，俞德帥，王顯

心血管疾病是影響人類健康疾病的首要重大因素，其死亡率呈不斷上升趨勢，最常見為冠狀動脈（冠脈）粥樣硬化性疾病。隨著對冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑牟粩嘌芯颗c探索，冠脈微血管疾病的研究已成為冠心病防治的熱點，經(jīng)皮冠脈介入治療（PCI）后微小栓子脫落造成微循環(huán)障礙的主要因素，此病理過程同本團(tuán)隊提出的絡(luò)風(fēng)內(nèi)動病機(jī)相似，尤以缺血性絡(luò)風(fēng)內(nèi)動證為主，但目前尚未具有成熟模型對其進(jìn)行深入研究，因此通過向大鼠冠脈注入同種異體血栓微顆粒及可以導(dǎo)致內(nèi)皮功能損傷的月桂酸鈉混合劑高度模擬冠脈微栓塞形成過程初步建立缺血性絡(luò)風(fēng)內(nèi)動證動物模型[1-5]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級（SPF）雄性SD大鼠，體重（260±20）g，由北京維通利華動物實驗中心提供[生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2016-0006]，分籠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科重點實驗室清潔級動物房，恒溫環(huán)境，標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。

1.2 試劑及儀器 月桂酸鈉（貨號L9755-5G，Sigma公司）；大鼠心肌肌鈣蛋白I（cTnI）試劑盒（批號：ka4341，Abnova公司）；大鼠血管假血友病因子（vWF）試劑盒（批號：mb-1962-a-a，北京賽譜銳思公司）；水合氯醛（上海滬試實驗器材公司）；4%多聚甲醛（北京綠源科技 novon）；鹽酸利多卡因注射液（中國大冢制藥有限公司）；40 U一次性胰島素注射器（美國BD公司）；玻璃分針（北京玻璃廠）；小動物呼吸機(jī)（型號：ALC-V8，上海奧爾科特生物有限公司）；生物光學(xué)顯微鏡（型號：BX60，OLYMPUS）；計算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)（版本：SPOT 4.6，美國Diagnostic Instruments）；全自動酶標(biāo)儀（型號：MK3，Thermo公司）；高速離心機(jī)（型號：TGL-1，上海安亭科學(xué)儀）；電子分析天平（型號：AR2140，上海奧豪斯生產(chǎn)）。

1.3 實驗分組 將72只體重（260±20）g的SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法先取出2只制備同種異體血栓，其余70只再同理隨機(jī)分為假手術(shù)組30只和模型組40只，實驗組動物分別于術(shù)后1h、術(shù)后3 h、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d和術(shù)后1周處死，各時間點保證每組5只大鼠存活。

1.3.1 同種異體血栓制備 將已配置好的10%水合氯醛按0.35 ml/100 g腹腔麻醉后進(jìn)行腹主動脈取血，靜置成固塊后于37℃恒溫箱中過夜。24 h后將干燥的血凝塊充分研磨后，38 μm孔篩過篩后分裝備用，確保顆粒大小均一。

1.3.2 開胸注入混合懸液制備模型 大鼠水合氯醛麻醉后行術(shù)區(qū)備皮，經(jīng)口腔行無創(chuàng)氣管插管術(shù)，確認(rèn)氣管位置后連接呼吸機(jī)輔助通氣，參數(shù)為潮氣量6 ml，吸呼比1：2，呼吸頻率為70 次/min，保證呼吸道通暢；沿大鼠右側(cè)胸骨第2~3肋間開胸，逐層剝離筋膜、肌肉層，暴露主動脈根部，玻璃分針分離主動脈根部周圍組織，穿過絲線使其充分暴露后用小動脈夾鉗夾升主動脈，助手穩(wěn)定血管的同時，術(shù)者將配制好的0.75 mg/ml月桂酸鈉溶液0.2 ml（用去離子水配）+2.5 mg血栓顆?；鞈乙河锰子斜Ｗo(hù)裝置的40 U胰島素注射器迅速垂直刺入血管并注射懸液，假手術(shù)組給予0.2 ml去離子水，總耗時大約5~8 s，注射完畢迅速拔出注射器及撤出動脈夾，同時棉球壓迫止血，未見出血，心率穩(wěn)定后，采用8字縫合法逐層關(guān)胸縫合，術(shù)后予0.1 ml利多卡因皮下注射防惡性心律失常，普通飲食水，連續(xù)3 d給予40萬U青霉素腹腔注射，預(yù)防感染，分別于術(shù)后相應(yīng)時間點取材。

1.3.3 模型評價 ①中醫(yī)證候評價：參照《胸痹心痛絡(luò)風(fēng)內(nèi)動證診斷專家共識》標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合缺血性絡(luò)風(fēng)內(nèi)動病機(jī)特點及動物自身特點，有絡(luò)虛、血瘀及風(fēng)動表現(xiàn)者作為考慮；②病理組織評價：以大鼠心肌相應(yīng)時間點微血管內(nèi)出現(xiàn)微血栓或血管周圍出現(xiàn)微梗死灶為宜，作為最佳評判模型成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 一般情況 實驗過程對大鼠體重、精神狀態(tài)、活動情況、舌色、毛發(fā)及爪甲耳廓顏色進(jìn)行動態(tài)觀察并記錄。

1.4.2 vWF、c TnI檢測 分別于術(shù)后1 h、術(shù)后3 h、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d和術(shù)后1周時，大鼠麻醉后腹主靜脈取血2 ml貼壁注入含有0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝采血管中，靜置后高速離心機(jī)3000轉(zhuǎn)/min離心10 min，用移液槍吸取上清液分裝于1.5 ml EP管中，做好標(biāo)記，放置于-20℃冰箱保存，采用全自動酶標(biāo)儀進(jìn)行ELISA法檢測。

1.4.3 病理組織檢測 分別于術(shù)后相應(yīng)5個時間點麻醉大鼠后，10%氯化鉀注射液2 ml快速推入腹主靜脈，使心臟停搏于舒張期。迅速開胸摘除心臟，生理鹽水沖洗后剪去心耳，生理鹽水恒壓灌流約直液體清亮后更換為4%多聚甲醛溶液繼續(xù)灌注，灌流結(jié)束后沿心臟最大橫徑垂直將心臟平均切成3段，厚度約3 mm，固定于4%多聚甲醛中24 h后脫水、石蠟包埋、切片、染色，光學(xué)顯微鏡觀察組織栓塞血管數(shù)量、血管損傷情況、炎細(xì)胞浸潤及微梗死情況，借助圖像分析軟件計算微梗死面積占視野面積百分比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組使用單因素方差分析（ANOVA），方差齊時可使用LSD檢驗，方差不齊則使用welch方法進(jìn)行對比分析。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組間大鼠的一般情況 術(shù)后兩組大鼠術(shù)后初期精神狀態(tài)及活動均較差，假手術(shù)組術(shù)后1周時精神活動接近術(shù)前；與假手術(shù)組相比，模型組喜歡蜷縮、瞇眼，術(shù)后1周時模型組仍狀態(tài)稍差，個別大鼠舌像可見舌質(zhì)紫暗，舌下脈絡(luò)瘀紫；爪甲及耳廓顏色兩組之間初期未見明顯異常，術(shù)后1周時模型組顏色略淡于假手術(shù)組。術(shù)前模型組和假手術(shù)組體重間對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，術(shù)后3 d時模型組體重下降多，但下降幅度對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），術(shù)后1周時，模型組較假手術(shù)組體重增長慢，但增長數(shù)值間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。實驗開始至術(shù)后1周，模型組死亡率為30%，假手術(shù)死亡率為6.7%，總體死亡率為20%。模型組成模率為80%。

表1 實驗大鼠術(shù)前及術(shù)后體重變化

2.2 各組間vWF水平比較 相同時間點：與假手術(shù)組相比：模型組術(shù)后1 h至術(shù)后3 d vWF濃度均低于假手術(shù)組，1周時高于假手術(shù)組；模型組術(shù)后1 d和術(shù)后3 d時，vWF水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），余時間點之間對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同時間點：①模型組之間：模型組中術(shù)后1 h至術(shù)后3 d時，vWF濃度呈逐漸降低趨勢，術(shù)后1周時較前略增高，組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；②假手組各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組之間cTnI水平比較 相同時間點：與假手術(shù)組對比，各時間點模型組cTnI濃度均高于假手術(shù)組，術(shù)后1 h和術(shù)后1 d濃度較假手術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余時間點之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同時間點：①模型組間：與模型組術(shù)后1 h對比，其他時間點cTnI濃度均明顯低于術(shù)后1 h組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。②假手術(shù)組間：各組間對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠病理組織表現(xiàn) ①微血管內(nèi)血栓形成（表4）：假手術(shù)組在各個時間段均未見明顯微血栓形成，模型組在術(shù)后1 h和3 h間均可見到微血管內(nèi)血栓形成，1 h數(shù)量多于3 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)后1 d、3 d、1周時均未看到明顯微血栓形成；②微血管損傷、炎細(xì)胞浸潤：假手術(shù)組未見，模型組在術(shù)后3 h可見微血管內(nèi)皮受損及炎細(xì)胞浸潤，持續(xù)至術(shù)后1周時仍可見，炎細(xì)胞浸潤隨時間逐漸加重；③心肌微梗死（表5）：假手術(shù)組各時間點未見梗死灶，模型組大鼠：術(shù)后3 d時可見多處以微血管周圍為主要表現(xiàn)的心肌組織壞死，伴炎癥反應(yīng)，術(shù)后1周時梗死仍存在，可見大量炎細(xì)胞，梗死面積所占視野百分比較術(shù)后3 d時減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

構(gòu)建缺血性絡(luò)風(fēng)內(nèi)動證動物模型是在大鼠冠脈微栓塞模型基礎(chǔ)上進(jìn)行，本團(tuán)隊認(rèn)為缺血性絡(luò)風(fēng)內(nèi)動證的主要病理因素為“絡(luò)結(jié)”和“絡(luò)弛”，“絡(luò)結(jié)”指絡(luò)脈管壁由于痰濁、瘀血、瘀脂等原因所致增厚、變硬、凹凸，影響絡(luò)脈正常的氣血流通而產(chǎn)生的一種病理狀態(tài)[6]?！敖j(luò)弛”則是絡(luò)脈因某種原因?qū)е陆j(luò)脈麻痹弛緩，血液滯留于局部而他處血少或無血，影響絡(luò)脈滲灌、返注的一種病理狀態(tài)。此病理生理過程引起內(nèi)皮損傷導(dǎo)致冠脈粥樣斑塊破裂、PCI后和溶栓療法后血栓脫落等導(dǎo)致遠(yuǎn)端微小血管阻塞過程較為相似，而臨床中由微小血管阻塞導(dǎo)致胸痛癥狀的患者，在具有心肌缺血癥狀冠脈造影顯示非阻塞性病變的患者中，其發(fā)生率約45%~60%，具有較高的研究價值。

目前關(guān)于冠脈微栓塞動物水平造模方法主要包括冠脈微栓塞劑法、自體血栓栓塞法及化學(xué)損傷法。其中冠脈微栓塞球法實驗所選用的微栓塞制劑為外源性物質(zhì)，不具有生物活性，實驗多通過介入方法，成本較高。自體血栓栓塞法栓塞劑為自體微血栓，富含豐富纖維素、血細(xì)胞、血小板等成分，但自體血栓通常成為非原位血栓，不以內(nèi)皮損傷為始動過程，與正常生理病理過程不完全相符；化學(xué)損傷法通過月桂酸鈉造成微血管內(nèi)皮損傷，脫落、穿孔，使血管完整性受損，誘發(fā)血小板黏附、聚集，最終導(dǎo)致原位微血栓的形成，但難以模擬破裂斑塊造成的彌漫性微栓塞過程[7,8]。以往實驗多采用自體血栓制備，每只大鼠均采用尾靜脈取血，操作較為繁復(fù)，本實驗采用同種異體血栓可以既能保證栓子的生物活性，又可減少自體血栓制備的繁復(fù)程度[9]，其與月桂酸鈉混合液同時注入，不但可模擬其血管內(nèi)皮損傷的情況，又可模擬栓子脫落到遠(yuǎn)端的過程，且能在較短時間內(nèi)構(gòu)建模型。

表2 實驗大鼠血漿血管假血友病因子濃度（ng/ml）

表3 實驗大鼠血漿肌鈣蛋白I（ng/l）

表4 不同時間點模型組和假手術(shù)組血栓形成數(shù)量（個）

表5 不同時間點假手術(shù)組和模型組微梗死情況（ ±s，%）

表5 不同時間點假手術(shù)組和模型組微梗死情況（ ±s，%）

注：與術(shù)后3 d比較，a P＜0.05

組別 樣本數(shù) 術(shù)后3 d 術(shù)后1周假手術(shù)組 3 0 0模型組 3 22.24±16.99 10.92±6.68a P值 — 0.000 0.000

本實驗中血栓顆粒大小和月桂酸鈉溶液濃度比通過預(yù)實驗摸索出的最佳結(jié)果為2.5 mg/ml和0.75 mg/ml混合0.2 ml懸液，但在預(yù)實驗探索過程中，發(fā)現(xiàn)在高濃度月桂酸鈉溶液可使血栓顆粒部分溶解，削弱一部分血栓微顆粒作用，月桂酸鈉自身也有可以損傷血管造成血栓形成的作用，作用機(jī)理仍需進(jìn)一步探究。

本研究中，大鼠血漿中cTnI水平：模型組術(shù)后均高于假手術(shù)組，且術(shù)后1 h最高，之后降低并維持一定水平，接近假手術(shù)組濃度，考慮術(shù)后1 h就可能出現(xiàn)微血管損傷，同時心肌損傷也可能伴隨出現(xiàn)，即形態(tài)學(xué)未見明顯變化，但在功能學(xué)方面改變相對出現(xiàn)較早，此過程同PCI中血管再通時由于栓子脫落導(dǎo)致急性心肌損傷病理過程相同，是高度模擬了PCI后栓子脫落導(dǎo)致微栓塞過程的體現(xiàn)。血漿中vWF水平：由于vWF作為膠原纖維和血小板的中介參與凝血過程，術(shù)后1 h和術(shù)后3 h凝血過程啟動血栓形成明顯，可檢測血漿vWF減少。當(dāng)凝血過程中消耗vWF增多時，機(jī)體代償性增加vWF的分泌，但初期不足以彌補(bǔ)vWF減少的含量，故在術(shù)后1 d、3 d時未見明顯血栓形成的情況下總量依然是低于正常水平，仍然呈下降趨勢。隨著凝血和抗凝動態(tài)平衡穩(wěn)定后，血栓形成減少甚至消失，血漿中vWF消耗減少，代償性的vWF增多，故在術(shù)后1周時可見vWF逐漸恢復(fù)正常甚至?xí)猿^正常水平，此后可能會恢復(fù)到正常水平，可進(jìn)一步延長觀察周期動態(tài)關(guān)注其變化過程。

病理學(xué)動態(tài)變化：①術(shù)后1 h即出現(xiàn)微栓塞的表現(xiàn)，持續(xù)至術(shù)后3 h仍可見，推測微血栓形成可能出現(xiàn)在更早的時間段，其中術(shù)后3 h可見有血管壁損傷時候表現(xiàn)為血栓數(shù)量較前下降，考慮開始時既有微栓塞注入到微血管形成的外來血栓，又有血管內(nèi)皮受損激活凝血系統(tǒng)產(chǎn)生的原位微血栓，此時內(nèi)皮損傷不明顯，因此未見明顯血管壁完整性破壞表現(xiàn)。隨著血栓數(shù)量增多，機(jī)體為維持凝血系統(tǒng)動態(tài)平衡將繼發(fā)性引起纖溶亢進(jìn)，纖溶酶原激活物增多，水解纖溶酶原為纖溶酶，降解纖維蛋白原，參與抗凝過程，一部分自身產(chǎn)生的原位血栓被水解，但原有的微栓子雖有一定活性但由于制備工序等與自身新鮮的原位血栓仍有區(qū)別，不能被迅速降解，因此術(shù)后3 h仍有少量血栓存在，術(shù)后1 d時未見明顯血栓顆粒也可作為上述現(xiàn)象理由之一。因此，如何鑒定是血栓微顆粒栓塞產(chǎn)生的血栓還是由月桂酸鈉損傷內(nèi)皮產(chǎn)生的原位血栓可以為我們提供新的思路，作為進(jìn)一步研究的對象，可采用特異性標(biāo)記的方式或者其他有效方法區(qū)分；②術(shù)后3 h后開始看到明顯血管壁中斷表現(xiàn)，心肌可見炎性細(xì)胞浸潤，以心外膜較為明顯，而術(shù)后1 d時未看到明顯血栓形成，但仍有炎細(xì)胞浸潤和受損的血管壁，提示機(jī)體損傷仍然存在；③術(shù)后3 d時機(jī)體開始有修復(fù)的表現(xiàn)，其抗損傷功能體現(xiàn)出明顯的作用，由于心肌再生能力微弱，故表現(xiàn)纖維組織和血管的再生，部分心肌可見多處小灶性梗死；術(shù)后1周時炎細(xì)胞數(shù)量較3 d時減少，以纖維母細(xì)胞為主，大量淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，伴有少量中性粒細(xì)胞，梗死區(qū)域可見大量新生毛細(xì)血管，數(shù)量較術(shù)后3 d時增多。組織修復(fù)能力進(jìn)一步提高。由于梗死區(qū)毛細(xì)血管大量增生，使得梗死區(qū)缺血情況得以改善，故一定時間內(nèi)代償后，可挽救心肌免于壞死、液化出現(xiàn)室壁瘤等嚴(yán)重表現(xiàn)。

中醫(yī)證候評價：根據(jù)缺血性絡(luò)風(fēng)內(nèi)動病機(jī)表現(xiàn)特點，其必備條件為絡(luò)虛和血瘀：①絡(luò)虛：絡(luò)虛通常為絡(luò)氣虛，可表現(xiàn)為年老體弱，血脈弛緩，與冠脈微栓塞長期內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致血管粥樣硬化的病理基礎(chǔ)較為相似，本模型通過損傷內(nèi)皮，模擬了氣血不和、絡(luò)氣虧損狀態(tài)，術(shù)后大鼠活動緩慢，精神遲鈍，瞇眼頻繁，耳廓、爪甲與舌象可見色淡苔白等癥狀均為絡(luò)虛的表現(xiàn)；②血瘀：在本實驗中，我們制備的同種異體血栓顆?？筛叨饶M“瘀血”病理產(chǎn)物，同時在藥劑注入后在內(nèi)皮損傷的基礎(chǔ)上加上血栓微顆粒彌漫性阻塞脈管微循環(huán)，模擬瘀血阻絡(luò)病機(jī)導(dǎo)致氣虛血瘀的過程。術(shù)后1周時，模型組大鼠舌質(zhì)暗紅伴有瘀血等癥狀亦是血瘀的表現(xiàn)；③動風(fēng)征象：術(shù)中大鼠開胸，宗氣外泄，撕破心包，心元大傷，藥劑注入后導(dǎo)致發(fā)病急驟，病情變化多端，可通過小血管內(nèi)血栓快速形成、心肌損傷標(biāo)志物升高、假血友病因子迅速減低體現(xiàn)，且病理動態(tài)演變過程是其變化的最佳證據(jù)，充分體現(xiàn)了“風(fēng)”的特點。

綜上，本模型具有缺血性絡(luò)風(fēng)內(nèi)動證的特點，可作為初步藥物干預(yù)研究基礎(chǔ)模型，為絡(luò)風(fēng)內(nèi)動病機(jī)理論學(xué)術(shù)提供新的科學(xué)研究平臺。