馮 炘 孫景紅 解玉紅，2

(1.天津理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與安全工程學(xué)院，300384 天津；2.易科力(天津)環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司，300384 天津)

0 引 言

近年來(lái)，煤的生物降解研究受到了廣泛的關(guān)注，研究表明微生物可破壞煤基質(zhì)結(jié)構(gòu)并釋放液體物質(zhì)。在過(guò)去幾十年中，在全國(guó)范圍內(nèi)學(xué)者們已經(jīng)利用各種煤和微生物進(jìn)行了研究，青霉菌(Penicilliumspp.)和黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)等真菌對(duì)煤的降解已被廣泛報(bào)道，結(jié)果表明褐煤更容易被真菌降解[1-2]。REISS[3]測(cè)試了7種擔(dān)子菌、1種子囊菌和5種疏水菌對(duì)德國(guó)煙煤和褐煤的溶解能力，其中3種杏鮑菇是最有效的，相應(yīng)的生物降解率在5.8%～7.6%；非擔(dān)子菌活性最低，降解率小于3.5%，完成轉(zhuǎn)化需要2周時(shí)間。由于褐煤的化學(xué)結(jié)構(gòu)與木質(zhì)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，因此，降解木質(zhì)素的真菌也具有降解褐煤的能力且對(duì)煤的降解效果很好[4-5]。

在大多數(shù)生物降解煤實(shí)驗(yàn)中，能降解木質(zhì)素的真菌菌株對(duì)煤的有效降解起著至關(guān)重要的作用。銀耳能夠在木屑環(huán)境下生存，但銀耳菌絲本身幾乎沒(méi)有降解木質(zhì)素的能力，而是由與銀耳相伴生長(zhǎng)的菌起主要作用[6]。因此，本研究從銀耳種子中分離到一株木霉菌(記為A-1)，研究該真菌的降解能力，并利用掃描電鏡、傅立葉紅外光譜(FTIR)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對(duì)煤樣及降解產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 煤樣及預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)所用的褐煤取自山西大同煤礦，先將煤塊破碎并取0.100 mm～0.125 mm的煤樣作為實(shí)驗(yàn)原煤，再對(duì)原煤進(jìn)行H2O2預(yù)處理。預(yù)處理可以提高煤炭的生物溶解度，H2O2相比其他強(qiáng)氧化物而言，對(duì)煤層微生物影響較小，且H2O2分解產(chǎn)生H2O和O2，污染較少。將原煤與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2按照1 g∶10 mL的比例進(jìn)行混合并于磁力攪拌器上攪拌15 h，然后用去離子水沖洗至濾液pH呈中性，于80 ℃烘箱中干燥36 h，使用Varro-ELIII元素分析儀測(cè)定原煤、H2O2預(yù)處理后的氧化煤和生物降解后殘煤的碳、氫、氧、氮、硫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2 菌種及培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用的木霉菌A-1是在實(shí)驗(yàn)室于銀耳種子中分離得到的。A-1菌分離步驟為：首先，將100 mL生理鹽水與5 g銀耳種子于錐形瓶中混合制備菌懸液，從菌懸液中取出1 mL原液加入含有9 mL生理鹽水的試管中，混合均勻，形成10-2的稀釋液；再?gòu)?0-2稀釋液中取出1 mL加入含有9 mL生理鹽水的試管中，混合均勻，形成10-3的稀釋液；同上，再依次稀釋為10-4和10-5，然后取稀釋后不同梯度的菌懸液各1 μL，用涂布棒均勻涂布在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(成分見(jiàn)表1)上。接種后，將培養(yǎng)基倒置于27 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d并每隔4 h觀察一次，挑取平板上不同形態(tài)菌株的單菌落并在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行多次培養(yǎng)直到獲得純菌株，將純菌株轉(zhuǎn)移至PDA斜面于4 ℃保存。

實(shí)驗(yàn)分離純化出三株菌株，為了挑選出有降解能力的菌株，對(duì)三株菌進(jìn)行預(yù)處理實(shí)驗(yàn)，即在以煤炭為唯一碳源的改良PDA培養(yǎng)基(成分見(jiàn)表1)中分別培育三株菌株，觀察三株菌株是否能夠利用煤炭生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)只有菌株A-1生長(zhǎng)，因此，挑選菌株A-1進(jìn)行菌株鑒定及褐煤的降解實(shí)驗(yàn)。將菌株進(jìn)行26S D1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定，以Seq Forward為引物進(jìn)行DNA測(cè)序，將DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行對(duì)比。

1.3 褐煤降解轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行生物降解褐煤實(shí)驗(yàn)。將木霉菌A-1接種到PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)48 h，將0.9%生理鹽水加入平板中形成菌懸液。為了便于后續(xù)取樣，選擇14個(gè)容量為150 mL的錐形瓶，洗凈、烘干，于錐形瓶中分別加入0.5 g預(yù)處理后的原煤、50 mL改良DOX培養(yǎng)基(成分見(jiàn)表1)，將瓶口包好，用高壓滅菌鍋于121 ℃滅菌20 min；再分別加入4 mL木霉菌懸液，于25 ℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2周，設(shè)計(jì)3組平行實(shí)驗(yàn)。降解實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，過(guò)濾，收集殘?jiān)?，去除降解產(chǎn)物中的殘余菌絲體，用蒸餾水對(duì)殘煤進(jìn)行清洗，烘干并稱重。木霉菌的生物降解率公式[7]為：

表1 培養(yǎng)基的成分

式中：w為生物降解率，%；m0為褐煤的初始質(zhì)量，g；m1為生物增溶后殘留褐煤的質(zhì)量，g。

1.4 降解產(chǎn)物的化學(xué)分析

降解產(chǎn)物采用傅立葉紅外光譜和氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析[8]。傅立葉紅外光譜用于確定降解后煤樣中特定的有機(jī)官能團(tuán)。用去離子水清洗降解實(shí)驗(yàn)中殘留的煤樣品，去除殘留煤中所有的真菌菌絲。將原始褐煤、預(yù)處理后的褐煤及降解后殘留的褐煤干燥24 h，再將0.2 g的每種樣品與20 g干燥的KBr混合研磨至粉末，壓片[9]。使用FTIR光譜儀在4 000 cm-1～500 cm-1光波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法中氣相色譜(GC)用于分離生物降解產(chǎn)物中的化學(xué)組分，質(zhì)譜(MS)用于鑒定每種成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)[10-11]。分別按照極性由低到高的順序采用正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯對(duì)降解液體產(chǎn)物進(jìn)行萃取，以10(有機(jī)溶劑)∶1(液體產(chǎn)物)的體積比于分液漏斗中進(jìn)行多次萃取[12]。將萃取后收集到的有機(jī)相部分濃縮、定容至最終體積1 mL，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析[13-14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 褐煤的元素分析

山西褐煤原樣、經(jīng)H2O2預(yù)處理后的氧化煤樣及生物降解后殘余煤樣的元素分析結(jié)果(每種樣品測(cè)試3次后取平均值)見(jiàn)表2。由表2可知，山西褐煤原煤碳元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.7%，屬于低階煤，該煤樣煤化程度低，容易受到微生物降解。氧化煤樣與原煤樣相比，碳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和氫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯減少，分別由71.7%和15.7%降低到69.7%和10.1%，而氧的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由4.5%增加到12.2%，由此表明，H2O2預(yù)處理使山西褐煤發(fā)生氧化，增加了煤中的氧含量，以氧鍵連接芳香族團(tuán)簇的形式存在，可能促進(jìn)真菌對(duì)煤結(jié)構(gòu)基質(zhì)的降解，從而釋放出多種有機(jī)物[13]。與氧化煤樣相比，菌株降解后的殘余煤樣碳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)又降低了2.2%，表明微生物對(duì)褐煤進(jìn)行了降解，形成小分子化合物溶于液體產(chǎn)物中，從而減少了碳的含量。

表2 山西褐煤的元素分析

2.2 木霉菌A-1的分離

對(duì)菌株A-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增26S D1/D2區(qū)序列，并測(cè)序。BLAST分析顯示，菌株A-1擴(kuò)增子序列與Trichodermacitrinoviride(MH877291.1)的同源性達(dá)到99%。目前，關(guān)于木霉屬降解褐煤的研究較少，已有文獻(xiàn)[5，15]中的木霉菌有Trichodermasp.AH和Trichodermaatroviride，但還未發(fā)現(xiàn)將Trichodermacitrinoviride菌株應(yīng)用于煤炭的生物降解研究。由于木霉菌屬能降解纖維素，山西褐煤中含有大量的類木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，因此，該菌株可能具有較強(qiáng)的煤炭降解能力，分離出的菌株如圖1a所示。

圖1 從銀耳種子中分離出的木霉菌株A-1及其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 降解率和降解時(shí)間

利用該真菌對(duì)H2O2預(yù)處理的山西褐煤樣品進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)過(guò)程中菌株A-1的生長(zhǎng)情況如圖2所示。由圖2可以看出，菌株A-1在以煤炭為唯一碳源的改良DOX培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，表明該菌株能夠利用煤炭，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)煤炭的生物降解。

圖2 降解過(guò)程中菌株A-1的生長(zhǎng)情況

表3所示為菌株A-1降解山西褐煤14 d時(shí)3組平行樣的降解率。由表3可知，在第14天時(shí)，真菌對(duì)H2O2預(yù)處理褐煤的平均降解率達(dá)到22.59%，該降解率經(jīng)條件優(yōu)化后還會(huì)有所提高。REISS[3]的研究結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的煤炭在2周內(nèi)降解率在7%～32%。這表明，從銀耳種子中分離出來(lái)的木霉菌具有較好的溶解效率，可能是由于該菌具有降解類木質(zhì)素的能力，從而有利于降解褐煤。

表3 木霉菌對(duì)H2O2預(yù)處理山西褐煤的生物溶解效果(14 d)

2.4 掃描電鏡分析

采用掃描電子顯微鏡對(duì)H2O2處理后的褐煤以及生物降解后褐煤殘?jiān)M(jìn)行觀察，照片如圖3所示。由圖3可以看出，原煤及H2O2處理后的褐煤為層狀結(jié)構(gòu)，表面粗糙，在一定程度上反映了褐煤的植物纖維狀結(jié)構(gòu)。氧化煤有較多的孔洞，這主要是由于H2O2的氧化作用使得原煤顆粒表面孔結(jié)構(gòu)增多，從而更有利于微生物進(jìn)入煤顆粒內(nèi)發(fā)揮作用。隨著微生物作用，煤炭結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，有大量的孔洞出現(xiàn)且孔隙增大，表明微生物改變了煤炭顆粒的大分子結(jié)構(gòu)。

圖3 煤樣的掃描電鏡照片

2.5 傅立葉紅外光譜分析

原煤、氧化后褐煤及生物降解后煤樣的紅外光譜如圖4所示。由圖4可以看出，溶解產(chǎn)物紅外光譜中的主要吸收帶歸因于羥基拉伸(3 000 cm-1～3 450 cm-1)、羰基(1 600 cm-1)、醚鍵(1 300 cm-1～1 000 cm-1)和側(cè)鏈芳香環(huán)(1 000 cm-1～500 cm-1)[5，16]。

由圖4還可知，降解后的殘余煤渣在某些波數(shù)區(qū)域內(nèi)吸收強(qiáng)度變?nèi)趸蛳?，說(shuō)明煤樣的有機(jī)大分子通過(guò)真菌降解為小分子?！狾H的觀測(cè)點(diǎn)在3 400 cm-1左右[17]，降解14 d的殘余煤樣中含有大量的羥基，原煤樣和H2O2氧化后的煤樣在3 431 cm-1處的吸收峰幾乎消失，表明存在較少的羥基，這可能是由于微生物分泌的代謝物裂解了許多結(jié)構(gòu)。3 000 cm-1～2 700 cm-1處主要是C—H鍵的伸縮振動(dòng)，2 925 cm-1處為C—H鍵的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)，微生物降解后該處的吸光度增大，表明微生物將煤樣中含C—H官能團(tuán)片段從煤大分子結(jié)構(gòu)中降解下來(lái)。1 000 cm-1～500 cm-1處為芳香族化合物中側(cè)鏈C—H和C—O鍵振動(dòng)[18]。與H2O2預(yù)處理后的褐煤樣品相比，降解后殘余煤樣中芳香環(huán)的側(cè)鏈吸光度較大，表明生物增溶褐煤過(guò)程中芳香環(huán)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，生成了多種側(cè)鏈，真菌降解了褐煤中的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，破壞了褐煤中的交聯(lián)體系，最終從復(fù)雜的褐煤結(jié)構(gòu)中釋放出簡(jiǎn)單的芳香結(jié)構(gòu)，并釋放到液體產(chǎn)物中。褐煤芳環(huán)側(cè)鏈?zhǔn)呛置航到鈾C(jī)理中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[11]。在原煤樣和氧化煤樣中，3 619 cm-1處存在一種胺，而在降解后的殘余煤樣中幾乎沒(méi)有這種胺，可能是由于該菌株破壞了胺結(jié)構(gòu)，進(jìn)而溶解褐煤。因此，降解產(chǎn)物中可能有一些胺類物質(zhì)和酯類物質(zhì)。酯鍵的振動(dòng)在波數(shù)范圍為1 360 cm-1～1 020 cm-1處，在1 318 cm-1處降解后的殘余煤樣相較于原煤及氧化煤，吸光度較大，表明該菌株降解褐煤的過(guò)程中，可能有一些酯類物質(zhì)被溶解到液體產(chǎn)物中。在1 650 cm-1～1 400 cm-1范圍內(nèi)，降解后的殘余煤渣含有更多的含氧官能團(tuán)，這可能是由該菌降解特定的官能團(tuán)導(dǎo)致的。這與殘余煤樣的元素分析結(jié)果相一致，經(jīng)真菌降解后的殘余煤樣中氧含量明顯增多，可能是由于真菌破壞了氧鍵連接的芳香族結(jié)構(gòu)，從而釋放多種有機(jī)物。

2.6 液化產(chǎn)物的GC-MS分析

分別用正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯三種有機(jī)物對(duì)降解14 d后的產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)萃取，對(duì)萃取后的產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。圖5所示為正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯三種有機(jī)溶劑萃取降解產(chǎn)物的總離子流色譜(TIC)。由圖5可知，萃取后分離出的物質(zhì)種類較多，將每個(gè)峰與標(biāo)準(zhǔn)圖庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)在萃取物中檢測(cè)到17種不同的化合物，檢測(cè)到的主要組分包括烷烴、醇類、酯類等脂肪族化合物和酚類有機(jī)物，部分有機(jī)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)表4。由表4可知，液化產(chǎn)物中含有乙酸異丁酯、對(duì)乙基苯酚、十六酸、2′-十二烷基-1，1′∶3′，1″-三聯(lián)環(huán)戊烷、2-甲基二十六(碳)烷、鄰苯二甲酸和3，5-二叔丁基苯酚，可見(jiàn)降解產(chǎn)物中主要成分含有烷烴、酯類等脂肪族化合物和酚類有機(jī)物，其中非極性組分含量較低，極性組分含量較高，可能是由于真菌釋放酶物質(zhì)破壞褐煤的分子結(jié)構(gòu)，然后釋放出小相對(duì)分子質(zhì)量的產(chǎn)物[19]。GC-MS結(jié)果與傅立葉紅外光譜分析結(jié)果相一致，表明降解產(chǎn)物中含有一些胺類、酯類及芳香族結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。結(jié)合GC-MS及FTIR分析結(jié)果可以推斷出該菌株A-1對(duì)山西褐煤的降解效果較好，降解產(chǎn)物中含有大量的有機(jī)小分子物質(zhì)。

圖5 降解產(chǎn)物的總離子流色譜

表4 正己烷和二氯甲烷及乙酸乙酯萃取的部分有機(jī)化合物

3 結(jié) 論

1)從能降解類木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的銀耳種子中分離到一株木霉菌(A-1)，利用該菌對(duì)山西褐煤進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在14 d時(shí)該菌對(duì)褐煤的平均降解率達(dá)到22.59%，表明該菌對(duì)山西褐煤具有增溶解聚作用，降解效果較好。

2)對(duì)降解前后的山西褐煤進(jìn)行掃描電鏡分析，結(jié)果表明微生物對(duì)山西褐煤進(jìn)行了降解，降解后的物質(zhì)溶出，形成孔洞結(jié)構(gòu)，孔隙增大。

3)對(duì)原煤、氧化后的煤及降解后的煤樣分別進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果表明該真菌A-1能將煤中芳香環(huán)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)打開(kāi)，生成多種側(cè)鏈，從而將大分子結(jié)構(gòu)分解為小分子，降解產(chǎn)物中主要含有羥基、芳香環(huán)、酯類等有機(jī)官能團(tuán)。

4)將降解后的液相產(chǎn)物分別用正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯分級(jí)萃取，利用GC-MS分析，發(fā)現(xiàn)生物降解產(chǎn)物中含有多種化合物，如烷烴、醇類、酯類等脂肪族化合物和酚類有機(jī)物，表明該菌株可以實(shí)現(xiàn)褐煤大分子結(jié)構(gòu)的降解。