丁 卓,崔浩楠,高 鵬

(1.東北農(nóng)業(yè)大學 園藝園林學院，哈爾濱 150030;2.農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學與 種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱 150030)

白粉病是危害葫蘆科蔬菜的世界性真菌病害之一，在葫蘆科作物的生產(chǎn)過程中廣泛發(fā)生，嚴重影響葫蘆科作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)的引起葫蘆科蔬菜感染白粉病的真菌屬于子囊菌亞門、核菌綱、白粉菌目下白粉菌屬、內(nèi)絲白粉菌屬、單囊殼屬等3個屬，可細分為6個種[1]。在中國侵染葫蘆科作物使其感染白粉病的主要病原菌是二孢白粉菌(Golovinomycescichoracearum，Gc;也為Erysiphecichoracearum)和單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii，Px)[2]。白粉病的發(fā)病速度和傳播速度極快，其孢子可通過空氣傳播，在高溫高濕條件下更有助于病害的發(fā)生。國內(nèi)春秋兩季的生產(chǎn)中，溫室大棚以及陸地都有不同程度的發(fā)生，影響葫蘆科作物的生長，使其生長緩慢，對產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴重危害[3]。選擇抗病品種是防治白粉病的有效途徑，抗白粉病育種成為主要的育種目標。

葫蘆(Lagenariasiceraria)屬于葫蘆科葫蘆屬，具有食用、藥用價值，是中國南方主要的蔬菜。同時葫蘆作為工藝品有經(jīng)濟和收藏價值，此外葫蘆作為西瓜重要的砧木材料，選擇抗白粉病的葫蘆作為嫁接砧木，能夠降低西瓜白粉病危害[4]。引起葫蘆科作物的白粉病菌有很多，不同地區(qū)致病的菌種并不相同。顧海峰等[5]對上海不同地區(qū)進行鑒定，引起致病的主要白粉病菌為單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii),優(yōu)勢生理小種為1號生理小種,浦東地區(qū)發(fā)現(xiàn)的生理小種為2F。引起北京地區(qū)的白粉病菌主要是Podosphaeraxanthii，優(yōu)勢生理小種則為2F[6]。徐志豪等[7]對侵染甜瓜的白粉病菌進行研究發(fā)現(xiàn)，生理小種主要為Podosphaeraxanthii生理小種1。雖然前人有關(guān)于葫蘆科相關(guān)作物白粉病菌研究的報道，但中國對于侵染葫蘆的白粉病菌研究報道少見，并且系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不明，觀察鑒定葫蘆白粉病的病原菌及其生理小種對葫蘆白粉病抗性育種具有重大意義。本研究于2018年8月在黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學設(shè)施園藝工程試驗中心種植葫蘆，等待其自然發(fā)病，觀察病原真菌的形態(tài)特征，以及克隆真菌ITS區(qū)序列進行Blastn分析，對侵染葫蘆的白粉病菌進行鑒定，確定其病原菌種類；同時將其ITS區(qū)與不同地區(qū)不同作物采集到的白粉病菌的ITS區(qū)進行系統(tǒng)進化分析；以期為葫蘆抗白粉病育種提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 白粉病菌分生孢子采集純化及生理小種的鑒定

2018年6月，在東北農(nóng)業(yè)大學設(shè)施園藝工程試驗中心種植葫蘆材料以及13份葫蘆科白粉病鑒別寄主，待葫蘆材料自然發(fā)病，從感染白粉病菌的葫蘆葉片上采集白粉病分生孢子。參考郭麗霞等[8]的方法對采集到的白粉病分生孢子進行單孢子分離純化培養(yǎng)，根據(jù)柯赫氏法則，將純化后的白粉病菌回接到葫蘆和13份鑒別寄主上，調(diào)查13份鑒別寄主的抗感情況。

1.2 觀察病原菌形態(tài)特征

對感染白粉病的葫蘆葉片采用考馬斯亮藍法進行染色觀察。將感染白粉病的葫蘆葉片浸泡在脫色液中(0.15%三氯乙醇-三氯甲烷)，60 ℃恒溫水浴直至葉片完全脫色，用清水沖洗后，浸泡于染色液中[0.15%三氯乙酸和 0.6%考馬斯亮藍 R-250(溶于99%甲醇中)混合液]，染色 5 min，取出后用清水沖凈，在光學顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子梗的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及分生孢子的形態(tài)，測定分生孢子和足細胞的長寬，與已知的白粉病病原菌形態(tài)進行比較鑒定。

1.3 白粉病菌DNA的提取

用軟毛刷采集感病葉片表面由單孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的白粉病菌分生孢子，采用改良的CTAB法[9-10]對白粉病菌的DNA進行提取，并溶解在ddH2O中。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取到的白粉病菌DNA的質(zhì)量與濃度。

1.4 PCR 擴增

1.4.1 引物序列 使用真菌核糖體ITS區(qū)段通用的ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)作為擴增葫蘆上白粉病菌ITS區(qū)的引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.2 PCR擴增體系 PCR 擴增反應(yīng)液總量為20 μL(ExTaq10 μL,上下游引物各1 μL，模板DNA 3 μL,ddH2O 5 μL)。

1.4.3 PCR反應(yīng)程序 94 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃變性45 s,60～45 ℃退火(每個循環(huán)降 0.5 ℃)45 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán)； 94 ℃變性45 s，45 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min，10個循環(huán)。

1.4.4 PCR產(chǎn)物的檢測 PCR 擴增反應(yīng)完畢后,取5 μL PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 克隆和測序分析

將PCR擴增后的產(chǎn)物利用膠回收試劑盒(TaKaRa)回收，將目的片段連接T1載體(TransGen Biotech)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)，在選擇培養(yǎng)基上篩選，挑取陽性克隆在LB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，通過菌液PCR進行檢測，將檢測后的菌落交由上海生工生物公司進行測序。將測序結(jié)果提交GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。并將測序得到的準確序列在NCBI網(wǎng)站上的GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進行Blastn分析,下載對比結(jié)果同源性高的菌種ITS區(qū)序列(含5.8s),利用ClustalX[11]軟件對序列進行多重比對,用MEGA6.0[12]對上述序列采用鄰近距離法(Neighbour-hoodJoining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹來進行系統(tǒng)進化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葫蘆白粉病菌的形態(tài)特征

利用考馬斯亮藍法對白粉病菌進行染色，結(jié)果如圖1所示，在顯微鏡下觀察到葫蘆上的白粉病菌的菌絲生長在大小不同、形狀各異的約8 μm左右寬的附著孢上，有隔膜，呈分枝狀、長直或彎曲。分生孢子呈橢圓或直筒形，大小為：長(28～42 μm)×寬(15～22 μm)，長寬比例平均為 1.5～ 2.0。分生孢子梗簡單無分枝，長90～260 μm、寬10～14 μm。足細胞呈圓形，長38～75 μm，肌底隔輕微收縮并且有1～4個短細胞，未見閉囊殼。分生孢子串生，內(nèi)含有纖維體，附著器乳頭狀，芽管通常較短，個別叉狀，末端加粗。白粉病菌的形態(tài)特征與單囊殼白粉病菌一致[13]，初步判斷為單囊殼白粉菌。

2.2 侵染葫蘆的白粉病菌生理小種的鑒定

對13份葫蘆科白粉病鑒別寄主[14]‘IranH’ ‘Topmark’ ‘Vedrantais’ ‘PMR45’ ‘PMR5’ ‘WMR29’‘Eidisto47’ ‘PI414723’ ‘MR-1’ ‘PI 124111’ ‘PI 124112’‘PMR6’和‘Nantais Oblong’接種白粉病，其抗感情況如表1所示。結(jié)果表明，東北農(nóng)業(yè)大學設(shè)施園藝工程試驗中心的葫蘆科白粉病菌屬于單囊殼白粉菌1號生理小種。

表1 鑒別寄主抗感反應(yīng)Table 1 Identification of host anti-sense response

2.3 葫蘆白粉病菌ITS區(qū)的PCR擴增及測序

采用真菌核糖體ITS區(qū)通用引物ITS1、ITS4對采集自葫蘆的白粉病菌DNA進行PCR擴增，得到一段582 bp的5.8srRNA-ITS區(qū)序列，通過連接T1載體進行測序得到該片段的序列(圖2)。這段序列已提交至NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GenBank數(shù)據(jù)庫中登記，登錄號為MG706136。

2.4 同源性序列的檢測

將MG706136在NCBI上進行Blastn分析，得到同源性較高的ITS序列。經(jīng)過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，同源性較高的序列均屬于子囊菌亞門，核菌綱，白粉菌目，白粉菌科，叉絲單囊殼屬，如表2(1～24)所示。

2.5 ITS序列的比對及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

將克隆得到的來自黑龍江省哈爾濱市的葫蘆科白粉病菌的ITS序列(MG706136)與下載到的叉絲單囊殼屬(Podosphaera)菌、高氏白粉菌屬(Golovinomyces)菌以及白粉菌科節(jié)絲殼屬杰絲殼屬(Arthrocladiella)菌的ITS序列(表2)進行多序列比對,再用MEGA6.0軟件采用近鄰歸群法(NeighborJoining,N-J)構(gòu)建獲得系統(tǒng)進化樹(圖3)，穆氏節(jié)絲殼菌(Arthrocladiellamougeotii)作為系統(tǒng)進化樹的外群。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，同屬于叉絲單囊殼屬的KX369541、MG462908、AB046988、AB046989、AB040302、AB040319、AB040346、AB040345、AB040294、LC270779、AB040337、AB040327、AB040329、AB040295、AB040323、KM260704、KM260719、KR779869、KM260735、FJ625796、JX546297、AB040332、AB040350和AB046987聚為一大類，屬于高氏白粉菌屬的AF229016、AF229017、AB022413、AB077670、AB077635、AB077652、AB077696和AF031282聚為一大類，而作為外群的AF073358單獨聚為一類。結(jié)果表明本研究在葫蘆上采集到的白粉病菌屬于叉絲單囊殼屬。

3 討 論

目前，對于葫蘆科白粉病菌的鑒別主要通過鏡檢的方法，通過觀察分生孢子是否具有纖維狀體，從而區(qū)分P.xanthii與G.cichoracearums[15-16]。這種方法操作簡便，但是要求試驗人員具備豐富的觀察經(jīng)驗，并且鏡檢方法無法得到更多的病原菌信息。被廣泛采用的形態(tài)學分類鑒定方法無法支持白粉病菌的系統(tǒng)進化研究，不利于追蹤白粉病的變異進化過程，因此必須進行分子層面的研究，核糖體RNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)存在種內(nèi)的豐富變異,進化的速率較快，廣泛用于研究屬內(nèi)種間以及種以下個體之間的遺傳關(guān)系，所以對葫蘆科白粉病菌進行ITS區(qū)測序及分析，不僅可以從分子水平進行有效鑒定，還可以為追蹤某一地區(qū)白粉病菌變異情況、研究白粉病菌之間的進化關(guān)系提供借鑒。

現(xiàn)在利用分子的手段對真菌種屬鑒定以及系統(tǒng)進化分析比傳統(tǒng)的方法更簡便更準確[17]。真菌菌種種類多，傳統(tǒng)方法對于某些形態(tài)特別相似的菌種鑒定過于困難，基于rDNA-ITS的序列分析能夠從核酸序列中獲得信息來反應(yīng)親緣關(guān)系，提高真菌鑒定的準確性。ITS區(qū)是rRNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，存在豐富的變異以及高多態(tài)性，不同的菌種之間，即使是非常近的兩個種，ITS序列都能表現(xiàn)出差異,但個體間的變異少見[18]。ITS區(qū)包含ITS1和ITS2兩個不同的非編碼區(qū),位于18S～5.8S rDNA和5.8S～28S rDNA，具有高度保守性，ITS區(qū)的基因片段并不長，約 1 000 bp，容易對其進行克隆和序列分析[19]。

本文利用真菌形態(tài)特征以及ITS序列分析兩種方法對葫蘆上收集到的白粉病進行鑒定。通過鏡檢觀察到的白粉病菌形態(tài)特征與感染葫蘆科作物的單囊殼白粉菌基本一致。同時將該白粉病菌測序得到ITS區(qū)序列結(jié)果在NCBI上進行Blastn分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)得到的序列與西瓜和苦瓜上分離得到的單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii)ITS區(qū)序列同源性為100%，系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，本研究分離到的病原菌與叉絲單囊殼屬的真菌聚為一群，因此進一步確定采自哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學的葫蘆白粉病菌為單囊殼白粉菌。

研究表明，白粉病菌基因組內(nèi)存在著大量的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，從而使得白粉病菌的基因組十分活潑，變異速度很快[10-23]。目前，大部分研究人員認為P.xanthii具有11個生理小種侵染葫蘆科作物，而McCreight[14]在綜合其他研究結(jié)果[24-34]基礎(chǔ)上，認為P.xanthii已分化出28種生理小種侵染葫蘆科作物。當前，關(guān)于甜瓜白粉病鑒別寄主的研究較少，雖然有研究者提出一種新的甜瓜白粉病鑒別方法[35]，但是在甜瓜白粉病的研究中未見使用，利用13份鑒別寄主依舊是鑒別甜瓜白粉病生理小種的公認方法。同一植株對不同生理小種的真菌表現(xiàn)出不同的抗性，因此鑒定侵染葫蘆植株的生理小種，對葫蘆抗病育種具有重要 意義。