龐丹丹，劉玉飛，孫云南，田易萍，宋維希，陳林波

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，云南勐海 666201；2.云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南勐海 666201)

苦茶(Camelliasinensis)是中國的一種特異茶樹種質(zhì)資源[1]，由其制成的茶葉感官品質(zhì)表現(xiàn)極苦，且與其他茶類的苦味不同，因此，被命名為苦茶。苦茶多分布于云南、四川，以及廣東、湖南、江西毗鄰區(qū)，尤以云南以及南嶺山脈兩側(cè)最多[2-3]。在苦茶的原生地，苦茶成為當(dāng)?shù)厝嗣裆畹谋仨毱?，將它作為一種藥物飲用，認(rèn)為長期飲用苦茶具有“退火發(fā)汗、解毒、治病”的功效[2]。研究已證實(shí)，苦茶嘌呤生物堿的組分與常規(guī)茶樹差異較大，其以苦茶堿(1,3,7,9-四甲基尿酸)為主，其次是咖啡堿、可可堿[3-4]，苦茶堿具有鎮(zhèn)靜催眠[5]、抗抑郁[6]等藥理活性，并且毒理試驗(yàn)鑒定苦茶堿為無毒[6]，其還可以削弱咖啡堿的興奮作用[7]，這使得苦茶的價(jià)值不斷提升，消費(fèi)需求連年增加。苦茶除含有高含量的苦茶堿外，還有非兒茶素類茶多酚[8]。同時(shí)，苦茶中還具有高含量的表沒食子兒茶素(EGC)，EGC含量與紅茶中關(guān)鍵品質(zhì)成分茶黃素的含量呈極顯著正相關(guān)[2,9]，所以苦茶可以作為選育和培育特異高級紅茶茶樹品種的育種材料；以往的研究表明，苦茶茶葉中存在一種具有丁香香氣的特殊物質(zhì)丁子香酚甙[2]。這說明苦茶還具有多種不同于常規(guī)栽培茶樹的特異性狀，這些性狀形成的機(jī)理、性狀相關(guān)基因標(biāo)記的開發(fā)以及遺傳機(jī)制的研究，都需要借助于苦茶資源。

當(dāng)前，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄組測序是基于Illumina平臺的第二代測序(SGS)技術(shù)生成的[10]。但是，SGS技術(shù)不能產(chǎn)生較長的轉(zhuǎn)錄本，并且SGS無法獲得可變剪接等信息，從而限制了該技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組測序中的利用[11]。而全長轉(zhuǎn)錄組測序是基于第三代測序(TGS)平臺進(jìn)行的，該方法可以產(chǎn)生長讀段，因此可以直接測序全長轉(zhuǎn)錄本[12]，在這方面全長轉(zhuǎn)錄測序優(yōu)于短讀測序；另外，它還可用于選擇性剪接事件及初級-前體-成熟RNA結(jié)構(gòu)的分析，以幫助更好地理解RNA的加工過程；此外，其可以在轉(zhuǎn)錄水平上全面分析由交替剪接和基因融合產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變異，比SGS更準(zhǔn)確地檢測結(jié)構(gòu)變異(SV)，使其適合于多倍體物種或具有高重復(fù)序列和高雜合性的物種的轉(zhuǎn)錄組分析[13]。由于茶樹基因組具有高的重復(fù)序列(至少包含64%的重復(fù)序列)和高的雜合度[14]，以及苦茶特異性狀形成機(jī)制需進(jìn)一步解析。因此，本研究以苦茶為材料，利用PacBio平臺進(jìn)行Iso-Seq，對所獲得序列與參考基因組比對、同時(shí)對其進(jìn)行功能注釋、基因結(jié)構(gòu)分析等，為苦茶特征形狀遺傳分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為更好地了解和利用這一重要的特異茶樹資源提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于測序分析的苦茶資源‘老曼娥苦茶’來源于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)基地，其6個(gè)不同組織(芽、葉、花芽、花蕾、莖和幼果)的樣品采摘后用液氮冷凍，并置于-80 ℃冰箱，之后送至諾禾致源科技股份有限公司(北京)進(jìn)行測序。

1.2 RNA提取與構(gòu)建文庫

參照張亞真等[15]的方法，分別提取苦茶芽、葉、花芽、花蕾、莖、幼果不同部位的總RNA，檢測合格后進(jìn)行等量混勻。利用帶有Oligo(dT)的磁珠從混勻后的RNA樣品中分離出mRNA，并利用SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，接著用BluePippin對cDNA進(jìn)行片段篩選，對全長cDNA進(jìn)行損傷修復(fù)、末端修復(fù)，并連接SMRT啞鈴型接頭，最終使用核酸外切酶消化獲得文庫。

1.3 Iso-Seq及組裝分析

采用軟件SMRT Link v5.0對輸出進(jìn)行過濾和處理，參數(shù)：--minLength=200，--minReadScore=0.75，最終得到的數(shù)據(jù)即為有效數(shù)據(jù)，校正后獲得CCS序列(Circular Consensus Sequence，參數(shù)：--minPasses=1，minPredictedAccuracy=0.8)；通過檢測CCS是否包含5′-primer、3′-primer、poly-A對CCS進(jìn)行分類找出FLNC(full-length non chimera)序列，之后對FLNC進(jìn)行聚類和校正，最終獲得polished consensus序列用于后續(xù)分析。使用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)軟件對單、二、三、四、五和六核苷酸的最低重復(fù)次數(shù)分別設(shè)置為10、6、5、5、5和5，進(jìn)行SSR搜索。

1.4 參考基因組比對及功能注釋

使用GMAP(http://research-pub.gene.com/gmap/)將三代測序reads比對到物種的參考基因組[16]，進(jìn)行飽和度曲線及轉(zhuǎn)錄本密度分析，并對未比對到參考基因組上轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行七大數(shù)據(jù)庫(NR、NT、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG、GO)的功能注釋。

1.5 基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄本與參考基因組比對結(jié)果，對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行再次校正，然后進(jìn)行利用SUPPA(https://bitbucket.org/regulatorygenomicsupf/suppa)、Tapis(https://bitbucket.org/comp_bio/tapis)等軟件進(jìn)行可變剪切分析、APA預(yù)測、新基因和新轉(zhuǎn)錄本鑒定、新基因數(shù)據(jù)庫注釋、轉(zhuǎn)錄因子分析。并利用CNCI(https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI)、PLEK(https://sourceforge.net/projects/plek/)、CPC(http://cpc.cbi.pku.edu.cn/)軟件以及Pfam數(shù)據(jù)庫對PacBio測序數(shù)據(jù)進(jìn)行編碼潛能預(yù)測，并將最終得到的LncRNA進(jìn)行后續(xù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Iso-Seq分析

2.1.1 測序結(jié)果與組裝全長 轉(zhuǎn)錄組測序共獲得8 730 808個(gè)Subreads(10G)，平均Subreads的長度為1 145 bp，N50為1 741。通過校正，CCS序列(環(huán)形一致性序列)有418 424個(gè)，含有5′端引物的reads數(shù)有338 306個(gè)，含有3′端引物的reads數(shù)目為368 458個(gè)，含有PolyA尾的reads數(shù)目為351 952個(gè)；全長序列數(shù)目為 295 803個(gè)，F(xiàn)LNC序列的數(shù)目有217 701個(gè)，且FLNC的平均長度為1 836 bp；最終獲得Polished consensus序列132 334個(gè)，用于后續(xù)分析。

2.1.2 SSR分析 利用MISA對苦茶全長轉(zhuǎn)錄組測序獲得的25 735條(大于500 bp)轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行搜索，共在12 926條轉(zhuǎn)錄本序列中發(fā)現(xiàn)符合標(biāo)準(zhǔn)的21 106個(gè)SSR位點(diǎn)，其中5 227個(gè)轉(zhuǎn)錄本含有大于1個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR的發(fā)生頻率為50.22%，SSR出現(xiàn)率為82%，平均2.4 kb出現(xiàn)1個(gè)SSR。在檢測到的苦茶轉(zhuǎn)錄組SSR中，單、二和三核苷酸重復(fù)類型的比例較大，分別占總SSR的32.49%、47.91%和16.18%；其他3種重復(fù)類型所占比例相對較少，只占總SSR的3.42%，結(jié)果見表1。苦茶轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布在5～46，其中5～10次重復(fù)的SSR位點(diǎn)有13 625個(gè)，占位點(diǎn)總數(shù)的64.56%；11～20次重復(fù)的SSR位點(diǎn)有7 299個(gè)，占總數(shù)的34.58%；20次重復(fù)以上的SSR位點(diǎn)有0.86%(表1)。

表1 苦茶SSR的類型、數(shù)量及分布頻率Table 1 Type, number and frequency of SSRs in Kucha

檢測到的苦茶全長轉(zhuǎn)錄組SSR核苷酸基序類型中(表2)，二核苷酸重復(fù)基序中AG/CT (7 720個(gè))，AT/AT(1 653個(gè))的出現(xiàn)頻率較高；三核苷酸中出現(xiàn)最多的重復(fù)基序是AAG/CTT(926個(gè))，其次是ACC/GGT(474個(gè))、ATC/ATG(446個(gè))。四核苷酸中以AAAT/ATTT(126個(gè))、AAAG/CTTT(47個(gè))、AAAC/GTTT(41個(gè))占優(yōu)勢；五核苷酸中分別以AAAAC/GTTTT(35個(gè))、AAAAG/CTTTT(34個(gè))和AAACC/GGTTT(27個(gè))出現(xiàn)頻率較高；AAAAAC/GTTTTT(16個(gè))是六核苷酸中出現(xiàn)頻率最高的，占其總數(shù)的12.5%，其次是AAAAAG/CTTTTT(14個(gè))和AACCCT/AGGGTT(13個(gè))。上述分析結(jié)果為下一步苦茶種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性的分析和遺傳圖譜的構(gòu)建等研究工作提供參考。

2.2 參考基因組比對與Unmapped轉(zhuǎn)錄本的功能注釋

分析與茶樹的參考基因組的比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)能比對到基因組上的一致性序列的reads共 105 898個(gè)，依據(jù)比對情況將序列分為五種類型：Unmapped、Multiple mapped、Uniquely mapped、Reads map to ‘+’、Reads map to ‘-’，同參考基因組比對結(jié)果見圖1。其中不能比對到基因組上(Unmapped)的reads有26 436個(gè)，占 19.98%；在參考序列上有多個(gè)比對位置(Multiple mapped)的reads有1 359個(gè)，占1.03%；在參考序列上有唯一比對位置(Uniquely mapped)的reads有104 539個(gè)，其中比對到基因組上正鏈(Reads map to ‘+’)的reads有101 781個(gè)，占76.91%；比對到基因組上負(fù)鏈(Reads map to ‘-’)的reads有2 758個(gè)，占2.08%。

為了獲得轉(zhuǎn)錄本全面的功能信息，將未比對到參考基因組上的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行七大數(shù)據(jù)庫(NR，NT，Pfam，KOG/COG，Swiss-Prot，KEGG，GO)的功能注釋，結(jié)果有11 152個(gè)轉(zhuǎn)錄本在NR數(shù)據(jù)庫中比對到311個(gè)物種上，比對上較多的5個(gè)物種包括茶樹Camelliasinensis(1 519個(gè))、葡萄Vitisvinifera(1 413個(gè))、胡桃Juglansregia(441個(gè))、中?？Х菴offeacanephora(376個(gè))、水芙蓉Nelumbonucifera(354個(gè))。從NR數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果來看，注釋到茶樹的基因最多，其次是葡萄；對基因進(jìn)行KO注釋的結(jié)果顯示，苦茶轉(zhuǎn)錄組中有10 976個(gè)得到注釋，與茶葉品質(zhì)相關(guān)的KEGG通路主要有氨基酸代謝途徑(409個(gè))、苯丙烷物質(zhì)的生物合成(70個(gè))，與茶葉香氣有關(guān)的KEGG通路主要有萜類物質(zhì)骨架生物合成(38個(gè))、倍半萜生物合成(114個(gè))、黃酮及黃酮醇的生物合成(2個(gè))，涉及苦茶中苦茶堿合成相關(guān)的嘌呤代謝(74個(gè))，與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的有64個(gè)，MAPK信號通路相關(guān)的則有31個(gè)等。同時(shí)在KOG數(shù)據(jù)庫中6 296個(gè)轉(zhuǎn)錄本得到注釋，其中注釋到次生代謝物合成、運(yùn)輸和代謝有425個(gè)，氨基酸運(yùn)輸和代謝的有357個(gè)，另外，還有6 221個(gè)轉(zhuǎn)錄本注釋到GO數(shù)據(jù)庫，由于同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本對應(yīng)到多個(gè)GO條目下，使得在GO數(shù)據(jù)庫中得到注釋的基因數(shù)要比注釋到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目多。

表2 苦茶全長轉(zhuǎn)錄組中SSR基序的分布Table 2 Distribution of SSR motif in full-length transcriptome of Kucha

2.3 基因結(jié)構(gòu)分析

結(jié)構(gòu)分析是三代全長轉(zhuǎn)錄組中的一個(gè)重點(diǎn)內(nèi)容，不同的樣本轉(zhuǎn)錄物不盡相同，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析，可以統(tǒng)計(jì)所有轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)差異，能夠準(zhǔn)確識別二代測序中無法區(qū)分的同源基因或者同源異構(gòu)體等。

2.3.1 可變剪切分析 利用SUPPA軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果(圖2)共獲得4 892個(gè)基因發(fā)生了可變剪切事件，其中外顯子跳躍事件(Skipped exon，SE)的基因有640個(gè)，占比為5.21%；外顯子互斥事件(Mutually exclusive exon，MX)的基因有43個(gè)，占比為0.35%；內(nèi)含子滯留事件(Retained intron，RI)的基因有1 635個(gè)，占比為 13.32%；5′UTR區(qū)可變事件(Alternative 5′ splice site，A5)的基因有947個(gè)，占比為7.71%；3′UTR區(qū)可變事件(Alternative 3′ splice site，A3)的基因有1 355個(gè)，占比11.04%；起始外顯子可變事件(Alternative first exon，AF)的基因數(shù)目有202個(gè)，占比1.65%；終止外顯子可變事件(Alternative last exon，AL)的基因數(shù)目有70個(gè)，占比 0.57%，其中內(nèi)含子滯留事件占最大比例，其次是3′UTR區(qū)可變事件。

2.3.2 新基因和新轉(zhuǎn)錄本分析 從與茶樹參考基因組比對結(jié)果來看，全長轉(zhuǎn)錄本可分為三類，其中比對到已知基因的已知轉(zhuǎn)錄本有10 842個(gè)，占比24.56%；已知基因的新轉(zhuǎn)錄本有26 184個(gè)，占比59.32%；比對到參考基因組未注釋區(qū)域的新基因有7 115個(gè)，占比為16.12%(圖3)。為了探究新基因的功能信息，同樣將新基因的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行七大數(shù)據(jù)庫(NR、NT、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG、GO)的功能注釋。NR數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示，3 627個(gè)轉(zhuǎn)錄本被比對到142個(gè)物種上，比對上的數(shù)目較大的物種分別為葡萄Vitisvinifera(866個(gè))、胡桃Juglansregia(176個(gè))、可可樹Theobromacacao(173個(gè))、中?？Х菴offeacanephora(136個(gè))、芝麻Sesamumindicum(135個(gè))、茶樹Camelliasinensis(121個(gè))、水芙蓉Nelumbonucifera(120個(gè))。以上的分析結(jié)果顯示，注釋到葡萄的基因數(shù)量最多，其原因有可能是茶樹與葡萄的親緣關(guān)系較近。

與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有575個(gè)轉(zhuǎn)錄本得到了注釋，在生物學(xué)過程類別中，代謝過程(259個(gè))、細(xì)胞過程(243個(gè))、單生物過程(176個(gè))最多；細(xì)胞組分類別中，細(xì)胞部分(120個(gè))、細(xì)胞(120個(gè))、細(xì)胞器(96個(gè))較多；分子功能類別中，結(jié)合活性(382個(gè))、催化活性(237個(gè))較多。根據(jù)它們參與的KEGG進(jìn)行分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新基因中有5 626個(gè)成功得到注釋，苯丙烷生物合成相關(guān)的有18個(gè)、其中與苦茶中苦茶堿合成相關(guān)的嘌呤代謝有17個(gè)，與茶葉品質(zhì)相關(guān)的氨基酸代謝有69個(gè)，與制成的茶葉相關(guān)的萜類化合物代謝有31個(gè)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的途徑有150個(gè)，其中植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有43個(gè)。在KOG數(shù)據(jù)庫中1 896個(gè)轉(zhuǎn)錄本被注釋，按照功能一共分成24類，其中一般功能預(yù)測最多，其次是翻譯后修飾、蛋白折疊和分子伴侶，之后為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

2.3.3 轉(zhuǎn)錄因子分析 本研究預(yù)測到的轉(zhuǎn)錄因子(TF)有1 918個(gè)，隸屬于84個(gè)TF家族，將注釋到轉(zhuǎn)錄本數(shù)目最多的前30個(gè)TF家族進(jìn)行柱形圖展示，分析結(jié)果如圖4。在獲得的TF家族中，bHLH家族有96個(gè)、C3H家族有80個(gè)、bZIP家族有70個(gè)、MYB-related家族有66個(gè)、C2H2家族有66個(gè)、MYB家族有57個(gè)。

2.3.4 LncRNA分析 經(jīng)過篩選后，依據(jù)在基因組的位置對最終得到LncRNA進(jìn)行分類，并對占比情況進(jìn)行展示，其中基因間區(qū)(LincRNA)最多，含有569個(gè)，占比73.14；完全位于蛋白編碼基因的intron區(qū)(Sense-intronic LncRNA)次之，有141個(gè)，占比為18.12%；與蛋白編碼基因的exon區(qū)有overlapping(Sense-overlapping)有42個(gè)，占比5.4%；反義鏈(Anti-sense_LncRNA)有26個(gè)，占比3.34%(圖 5-A)；各軟件預(yù)測為noncoding的轉(zhuǎn)錄本條數(shù)畫成維恩圖，結(jié)果展示(圖5-B)。

3 討論與結(jié)論

目前，PacBio-Iso-Seq測序手段已在多種植物中得到了廣泛的應(yīng)用，該方法相比于二代測序具有讀長長、無需組裝轉(zhuǎn)錄組就可以直接獲得全長轉(zhuǎn)錄本、更準(zhǔn)確地檢測結(jié)構(gòu)變異和適合于具有高重復(fù)序列和高雜合性的物種的轉(zhuǎn)錄組分析等優(yōu)勢[11-13]。本試驗(yàn)利用Iso-Seq技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，獲得了苦茶全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

本研究共得到8 730 808個(gè)Subreads，平均Subreads的長度為1 145 bp，N50為1 741，可以看出全長轉(zhuǎn)錄組測序讀長長且連續(xù)性較高。全長非嵌合(FLNC)reads有217 701個(gè)，通過對FLNC-reads的聚類及校正分析，最終獲得polished consensus序列132 334個(gè)。龐丹丹等[17]對不同葉色的6份茶樹材料進(jìn)行二代測序，共獲得112 233個(gè)Unigene，平均長度為759 bp，N50為 1 081 bp。Li等[18]采用RNA-seq對龍井43的根、莖、4個(gè)不同嫩度的葉片及花蕾和果實(shí)等13個(gè)組織進(jìn)行測序分析，共獲得347 827條Unigene(>200 bp)，平均長度為791.2 bp，N50為1 342 bp。上述結(jié)果表明在獲得的序列質(zhì)量和基因數(shù)等方面，三代測序結(jié)果均優(yōu)于二代測序。

苦茶的全長轉(zhuǎn)錄組測序在很大程度上補(bǔ)充了現(xiàn)有茶樹基因資源，并為發(fā)現(xiàn)新的或以前未被識別的蛋白質(zhì)的編碼基因和轉(zhuǎn)錄亞型提供了優(yōu)勢。與茶樹參考基因組比對，分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)PacBio轉(zhuǎn)錄本是已知基因的新亞型(59.32%)，有 16.12%的轉(zhuǎn)錄本為7 115個(gè)新基因提供了證據(jù)(圖3)。分析表明，新的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對探究苦茶的注釋具有巨大的潛力。Unmapped轉(zhuǎn)錄本在NR數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果顯示，共比對上311個(gè)物種，比對到最多的物種仍是茶樹，其次是葡萄，這表明比對所用到的參考基因組可能還需進(jìn)一步完善。比較KEGG(10 976+5 626)、KOG (6 296+1 896)、GO(6 221+575)3大數(shù)據(jù)庫功能統(tǒng)計(jì)情況，發(fā)現(xiàn)注釋到KEGG的轉(zhuǎn)錄本數(shù)最多(括號內(nèi)數(shù)值為未比對到基因組的轉(zhuǎn)錄本和新轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，下同)，這些轉(zhuǎn)錄本中包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄本與茶葉品質(zhì)和苦茶特征性狀形成相關(guān)的代謝途徑，如苦茶堿等嘌呤生物堿代謝(74+17)、氨基酸代謝(409+69)、苯丙烷生物合成(70+18)和萜類物質(zhì)的生物合成(152+31)等。Wang等[19]對3個(gè)苦茶品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過與嘌呤生物堿代謝的KEGG通路富集分析，篩選出一批與苦茶堿和咖啡堿生物合成相關(guān)的關(guān)鍵基因。同樣，本研究新注釋到的一些轉(zhuǎn)錄本亦能夠?yàn)楹笃趯嗖栊誀钚纬傻难芯刻峁┗蛸Y源。

可變剪切(Alternative splicing，AS)，即某些基因的一個(gè)mRNA前體以不同的剪接方式，形成不同的mRNA異構(gòu)體[20]；其能夠調(diào)控基因的表達(dá)水平和促進(jìn)蛋白質(zhì)組的多樣性，在植物生長、發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[21-23]。選擇性剪接的亞型具有基于組織或時(shí)間的優(yōu)先表達(dá)特征，并且它們也受環(huán)境條件的影響[24]。在茶樹中，研究發(fā)現(xiàn)可變剪切亞型在高溫、干旱、低溫等不同環(huán)境脅迫條件下的表達(dá)模式存在明顯差異[25-26]，同時(shí)可變剪切事件還參與了黃酮、類黃酮和花青素等重要物質(zhì)的次生代謝過程中[24, 27-28]。因此，對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4 892個(gè)基因發(fā)生了選擇性剪接，其中內(nèi)含子滯留事件占比最大，這為進(jìn)一步研究可變剪切在苦茶特異成分代謝中的作用奠定了基礎(chǔ)。

以往的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子(TF)參與植物多種生長代謝過程中。在茶樹中，發(fā)現(xiàn)它們不僅參與葉片花等器官的發(fā)育[29-30]，以及脅迫反應(yīng)[31]，還參與兒茶素[17]、茶氨酸[32]和花青素[33-34]等多種次生代謝過程。本研究還預(yù)測得到1 918個(gè)TF，在獲得的TF家族中，bHLH家族有96個(gè)、C3H家族有80個(gè)、bZIP家族有70個(gè)、MYB-related家族有66個(gè)、C2H2家族有66個(gè)、MYB家族有57個(gè)。這些轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測與分析，為之后研究苦茶特異性狀(苦茶堿[3-4]、丁子香酚甙[2]和高EGC[9]等)相關(guān)基因表達(dá)以及詳細(xì)的基因家族分析提供數(shù)據(jù)。此外，本研究還預(yù)測得到778個(gè)LncRNA，它們可能在茶樹次生代謝的調(diào)控中起著特殊的作用。

本研究為苦茶品質(zhì)和特異性狀形成機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，上述結(jié)果將有助于進(jìn)一步開展苦茶特異性狀相關(guān)基因標(biāo)記的開發(fā)、并為其形成的機(jī)理及遺傳機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。