李林飛，王朦，宋銀森，史利歡，趙鼎

（鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童遺傳代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州兒童醫(yī)院，河南 鄭州450000）

急性淋巴細(xì)胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種主要起源于B 系或T 系淋巴祖細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生的惡性腫瘤性疾病，約占兒童急性白血病的80%以上。0～9 歲兒童為發(fā)病高峰，污染區(qū)、油田等地區(qū)發(fā)病率明顯偏高。小兒ALL 最多見為 L1 型，占 70%，L2 型為 25%左右，L3 型占5%以下。

近年來根據(jù)ALL 分型制定個(gè)體化方案已取得較好療效，5 年生存率高達(dá)80%以上。因此，及早經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段明確ALL 可疑兒童診斷與分型，有助于提高其預(yù)后及改善生活質(zhì)量，其中分子細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)是ALL 明確診斷與預(yù)后評(píng)估必不可少的手段。我們采用ALL 多探針技術(shù)對(duì)本地區(qū)173 例初診ALL 兒童分子細(xì)胞遺傳學(xué)改變進(jìn)行探究，以了解ALL 多探針系統(tǒng)在兒童ALL 診療中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 2017 年 2 月-2019 年 1 月在我院血液腫瘤科住院期間初診ALL 兒童患者173 例，其中男性98 例，女性75 例，男女比例1.31:1，最大年齡14 歲，最小年齡僅3 個(gè)月。所有患者診斷均嚴(yán)格按照《血液病診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)》第2 版。本研究經(jīng)鄭州兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 ALL 多探針系統(tǒng)檢測(cè) ALL 多探針系統(tǒng)共包括 cMYC 斷裂點(diǎn)探針、P16 缺失探針、E2A 斷裂點(diǎn)探針、CHIC2/D10Z1/D17Z1 超二倍體探針、TEL/AML1 雙融合探針、MLL 斷裂點(diǎn)探針、BCR/ABL1雙融合探針及IGH 斷裂點(diǎn)探針8 組探針（英國Cytocell），按特定設(shè)計(jì)分別固定于一張標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)玻片上。該檢測(cè)采用多探針FISH 技術(shù)對(duì)初診ALL 患兒骨髓標(biāo)本進(jìn)行處理、細(xì)胞收獲、制片、變性、雜交、洗脫、熒光染色等操作。

1.2.2 熒光顯微鏡觀測(cè) 在Leica GSL-10 全自動(dòng)工作站熒光顯微鏡下通過三色濾光模塊觀察雜交信號(hào), Cytovision 軟件進(jìn)行熒光圖像分析，每種探針分別計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞所占比例超過10%可判為陽性結(jié)果。

2 結(jié)果

ALL 多探針系統(tǒng)對(duì)173 例初診ALL 兒童檢測(cè)中，共檢出112 例陽性改變，陽性率為64.74%，分別涉及 cMYC、P16、E2A、TEL/AMLl、CHIC2/D10Z1/D17Z1、MLL、BCR/ABL1、IGH 等 8 種單一陽性改變109 例或合并至少兩種陽性改變3 例，其中CHIC2/D10Z1/D17Z1 超二倍體檢測(cè)陽性率最高，共76 例，陽性率為 43.93%，其次是 TEL/AMLl 陽性，共19 例，陽性率為10.98%，另檢出8 例信號(hào)異常，但均未發(fā)現(xiàn)陽性異常。112 例兒童ALL 多探針系統(tǒng)FISH 陽性結(jié)果，見表1，另本檢測(cè)中檢出1 例患兒BCR-ABL1 融合基因陽性，見圖1。

表1 112 例兒童ALL多探針系統(tǒng)FISH陽性結(jié)果

圖1 1 例BCR/ABL1 融合基因陽性患兒ALL多探針檢測(cè)結(jié)果

3 討論

急性淋巴細(xì)胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia, ALL) 是兒童時(shí)期最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其白血病的發(fā)生、發(fā)展起源于不同淋巴祖細(xì)胞的惡性改變，病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確[1,2]。通常認(rèn)為，白血病的發(fā)生是多種遺傳與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果[3],主要與以下危險(xiǎn)因素有關(guān):遺傳及家族因素，環(huán)境因素(電離輻射、化學(xué)致癌物、病毒感染等)，基因改變(染色體異常、點(diǎn)突變等)。大約60%-85%的ALL 患者可檢出克隆性染色體異常，其中多數(shù)為特異性染色體重排。ALL 特異細(xì)胞遺傳學(xué)改變與其不同生物學(xué)特性及預(yù)后有明顯相關(guān)性，具有重要的臨床和生物學(xué)意義。本研究旨在探討ALL 多探針系統(tǒng)在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療中的應(yīng)用價(jià)值，通常涉及分子細(xì)胞遺傳學(xué)改變包括融合，斷裂、缺失及超二倍體等。

在173 名初診ALL 兒童中，我們檢測(cè)到兒童CHIC2/D10Z1/D17Z1 超二倍體陽性最多,共76 例，陽性率為43.93%。超二倍體是指除正常染色體組以外,還有一條或幾條額外的染色體或染色體片段的細(xì)胞或個(gè)體，部分ALL 患者攜帶超二倍體。大多數(shù)此型患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)不高，化療效果好，預(yù)后較好。雖然超二倍體可累及任何一條染色體，但以4、6、10、14、17、18、20、21 及 X 染色體最常見[4],美國CDG 研究組亦發(fā)現(xiàn)，第 4、10、17 對(duì)染色體三體是獨(dú)立的預(yù)后良好的因素[5]。

其次是TEL/AML1 陽性，共19 例，陽性率為10.98%。文獻(xiàn)報(bào)道，TEL/AML1 是兒童 ALL 中最常見的異常融合基因，見于12%~27%的兒童B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病[6]。該類陽性患者具有早期白細(xì)胞計(jì)數(shù)不高，化療效果佳，完全緩解期長(zhǎng)，早期不易復(fù)發(fā)等臨床特點(diǎn)，因此檢測(cè)到TEL/AML1 陽性預(yù)示預(yù)后良好。本組陽性率結(jié)果低于文獻(xiàn)報(bào)道，可能與初診ALL 納入標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)本量有關(guān)，也應(yīng)重視ALL 多探針檢測(cè)本身技術(shù)的特點(diǎn)使其對(duì)標(biāo)本中陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)及熒光信號(hào)的質(zhì)量非常依賴,需在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)200 個(gè)熒光細(xì)胞,陽性細(xì)胞超過閾值才提示標(biāo)本陽性，警惕玻片前處理不當(dāng)、熒光信號(hào)差、閾值差異、人為計(jì)數(shù)誤差等原因均可導(dǎo)致假陰性出現(xiàn)。一般來說,傳統(tǒng)核型幾乎無法檢出TEL/AML1 異常,主要是由于該易位片段十分微小[7],故此融合基因檢測(cè)相對(duì)更有意義和價(jià)值。

另ALL 多探針系統(tǒng)可檢出MLL(11q23)基因異常，MLL 斷裂點(diǎn)異常在兒童ALL 中占2%~6%，其畸變類型包括缺失,插入,重復(fù)及易位[8]。MLL 易位重排相關(guān)的基因眾多,,常見的有AF4(4q21)、AF6(6 q27)、AF9(9p21-22)、AF10(10p12)和 ENL(19p13.3)等, 這些基因通常與MLL 基因發(fā)生易位后可形成MLL 融合基因?qū)е掳籽〉陌l(fā)生[9]。本組ALL 患者的MLL 陽性率為4.62%, 與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符[10]。此型患者臨床表現(xiàn)較典型: 初診時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)高,常規(guī)化療效果不好, 且對(duì)大劑量糖皮質(zhì)激素耐藥,完全緩解率低，生存期短[11]。所以檢測(cè)到此類異常的患者一般預(yù)后較差，特別是幼兒患者預(yù)后更差。

其余分子細(xì)胞遺傳學(xué)異常包括cMYC 斷裂點(diǎn)陽性、P16 基因缺失、E2A 斷裂點(diǎn)陽性、BCR/ABL融合基因陽性、IGH 斷裂點(diǎn)陽性, 絕大多數(shù)白血病患者檢測(cè)到此類異常通常提示預(yù)后不良。cMYC 基因位于8q24[12],在B 細(xì)胞ALL 中往往出現(xiàn)其與IgK(2p13)、IgH(14q32)、Igλ(22q11)等 Ig 基因之間的相互易位，從而組成一個(gè)重排基因，具有高轉(zhuǎn)活性，啟動(dòng)cMYC 轉(zhuǎn)錄并增強(qiáng)cMYC 表達(dá),最終導(dǎo)致細(xì)胞惡變及腫瘤發(fā)生。P16 基因位于9p21，該缺失將會(huì)引起很多腫瘤病，可導(dǎo)致兒童ALL 的發(fā)生。E2A 基因位于 19p13，PBX1(1q23)和 HLF(17q22)可與其發(fā)生融合，導(dǎo)致t(1;19)和t(17;19)易位，前者在兒童B急淋中更多見，且該型較易復(fù)發(fā)。BCR/ABL 融合基因是9 號(hào)染色體和22 號(hào)染色體易位產(chǎn)物[13]，3-5%的兒童ALL 患者會(huì)出現(xiàn)該異常。IgH 基因位于14q32，可與多種染色體如1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 11,12, 13, 14, 17, 18, 19 和22 等形成不同的染色體融合, 其中最常見的易位為IgH/BCL2 和IgH/CCND1，另IGH 探針能夠檢出各種形式的IgH 重排。

因此，ALL 多探針系統(tǒng)是兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療中較好的檢測(cè)手段。首先，由于ALL 多探針是應(yīng)用多種已知與白血病相關(guān)的核酸序列作為探針，與靶DNA 進(jìn)行FISH 雜交，只需簡(jiǎn)單觀察熒光信號(hào)數(shù)目即可進(jìn)行ALL 診斷，檢測(cè)結(jié)果也更加客觀、準(zhǔn)確、可靠。其次，ALL 多探針系統(tǒng)檢測(cè)白血病患者骨髓液是否存在遺傳學(xué)改變,相比于骨髓細(xì)胞核型分析中常出現(xiàn)的可分析分裂象少,染色體粗短,分散不良、容易培養(yǎng)失敗等現(xiàn)象[14],成功率幾乎100%。另外，應(yīng)用ALL 多探針系統(tǒng)常在獲取標(biāo)本后1~2d 便可得出結(jié)果,與傳統(tǒng)的核型分析（2~3周）相比在時(shí)間上大大縮短[15]，從而減輕患兒家屬等待結(jié)果期間的不安和焦慮,同時(shí)縮短疾病的診療周期。

綜上所述, 兒童ALL 患者分子細(xì)胞遺傳學(xué)改變不盡相同，其疾病表現(xiàn)、免疫分型、對(duì)治療的反應(yīng)及臨床預(yù)后也各有不同。ALL 多探針系統(tǒng)可一次性檢出多種與兒童ALL 相關(guān)的細(xì)胞遺傳學(xué)改變，不僅準(zhǔn)確、高效、省力、省時(shí)，而且檢測(cè)效率極高，臨床實(shí)用性強(qiáng)，非常有利于兒童ALL 患者的細(xì)胞遺傳學(xué)診療及預(yù)后評(píng)估,在協(xié)助其精準(zhǔn)診療中具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。