張燕，陳明軍，呂永磊，金新莉，方建華，李建斌

（河南省紅十字血液中心，河南 鄭州450000）

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay） 是國內(nèi)血站篩查實驗室檢測HBsAg、抗-HCV、HIV 和抗-TP 的最常用的方法[1]。為了防止弱陽性標本漏檢,最大限度的確保血液安全,很多實驗室按照試劑說明書要求臨界值的0.5~0.9 倍設(shè)置自己實驗室的臨界值[2]，即所謂的“灰區(qū)”。我們實驗室也不例外，ELISA 檢測所用8 種試劑的臨界值定為0.7 倍cutoff，即檢測值(S/CO)大于或等于0.7 的標本判定為不合格。隨著血站系統(tǒng)檢測試劑靈敏度的不斷提高和核酸檢測的全覆蓋，ELISA 檢測“灰區(qū)”的存在是否還有必要，本文通過對ELISA 四項的血清盤進行檢測，分析灰區(qū)設(shè)置的必要性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 乙肝表面抗原檢測試劑盒 (1--23081、2--23043) ，丙肝抗體檢測試劑盒 (1--23081、2--23001) ，人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒( 1--23081) ，人類免疫缺陷病毒抗原/抗體檢測試劑盒( 2--23089) ，梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒( 1--23081、2--23043)。Microlab STAR 全自動樣本處理系統(tǒng) ( 瑞士哈美頓) ，Microlab FAME 全自動酶免分析儀( 瑞士哈美頓)，Sunrise 酶標儀( 瑞士帝肯) 等。質(zhì)控品為酶免四項混合質(zhì)控，來源于北京康徹思坦生物有限公司。

1.2 血清盤的來源與構(gòu)成 血清盤來源于國家衛(wèi)健委臨檢中心，2017 年11 月份到12 月份，我們實驗室參加了衛(wèi)健委臨檢中心組織的多中心評估活動，全國21 家血液中心和中心血站參與，包括7家發(fā)光系統(tǒng)和6 家酶免試劑，其中HBsAg 共有9個血清盤，共計792 個標本，包括423 個真陽性+質(zhì)控76 個+特殊設(shè)計樣本97 個+不確定 8 個+真陰性 188 個；抗-HCV 共 8 個血清盤，共計 704 個標本，包括真陽性318 個+質(zhì)控128 個+真陰性155個+103 個不確定；HIV 共 4 個血清盤，共計 330 個標本，包括149 個真陽性+質(zhì)控76 個+5 個不確定+78 個真陰性標本；抗-TP 共7 個血清盤，共計616個標本，包括373 個真陽性+質(zhì)控84 個+特殊樣本11 個+不確定 18 個+真陰性 130 個。

1.3 血清盤的判定規(guī)則 國家衛(wèi)健委臨檢中心使用8 種ELISA 試劑和7 種化學發(fā)光試劑對血清盤結(jié)果進行確認，所有試劑結(jié)果均為反應(yīng)性的標本判定為真陽性，反之則判定為真陰性。結(jié)果不一致時采用確證實驗，其中HBV 采用中和實驗（羅氏、雅培、索林）、核酸和“兩對半”；HCV 采用 RIBA 和核酸實驗；HIV 采用WB 和核酸實驗；TP 采用TPPA 和RIBA。確定實驗和核酸檢測均為反應(yīng)性時判定為真陽性，反之則判定為真陰性，兩者結(jié)果不一致時判定為不確定。本文中納入統(tǒng)計結(jié)果的標本為真陽性和真陰性標本。

1.4 灰區(qū)設(shè)置 本實驗室所用8 種ELISA 試劑的灰區(qū)設(shè)置為0.7～1.0，即S/CO≥0.7 判定為有反應(yīng)性；S/CO＜0.7 判定為無反應(yīng)性。

1.5 統(tǒng)計方法 將檢測結(jié)果與最終判定結(jié)果比較，計算各試劑的檢測靈敏度 （檢測為真陽性數(shù)量/確證為真陽性數(shù)量×100%）、檢測特異性（檢測為真陰性數(shù)量/確證為真陰性數(shù)量×100%）、約登指數(shù)（為靈敏度+特異性）-1。統(tǒng)計工具采用2010 版EXCEL。

2 結(jié)果

2.1 兩種HBsAg ELISA 試劑結(jié)果分析 納入統(tǒng)計的HBV 標本共計611 例，見表1。從結(jié)果來看，兩種HBsAg ELISA 存在一定比例的假陰性標本。而我實驗室設(shè)置的臨界值0.7 和試劑說明書上臨界值為1，就靈敏度、特異性和約登指數(shù)來看，沒有明顯差異。

表1 兩種HBsAgELISA結(jié)果分析

2.2 兩種抗-HCV ELISA 試劑結(jié)果分析 納入統(tǒng)計的HCV 標本共計473 例，見表2。從結(jié)果來看，兩種抗-HCV ELISA 試劑的靈敏度與臨界值為0.7和1 時沒有明顯差異，但是兩種試劑的特異性在臨界值為1 時有顯著提高。

表2 兩種抗-HCVELISA結(jié)果分析

2.3 兩種HIV ELISA 試劑結(jié)果分析 納入統(tǒng)計的HIV 標本共計 227 例，見表3。從結(jié)果來看，進口試劑靈敏度為100%，而特異性在臨界值為1 時提高到92.3%； 國產(chǎn)試劑在靈敏度稍低于進口試劑，特異性在臨界值為1 時也有所提高。

表3 兩種HIVELISA結(jié)果分析

2.4 兩種抗-TP ELISA 試劑結(jié)果分析 納入統(tǒng)計的TP 標本共計 503 例，見表4。從結(jié)果來看，兩種ELISA 試劑的靈敏度都大于99%，但都存在一定比例的假陽性，不設(shè)置灰區(qū)時特異性有所提高。

表4 兩種抗-TPELISA結(jié)果分析

2.5 8 種ELISA 試劑最佳臨界值的確定 圖1 為7種國產(chǎn)ELISA 試劑的臨界值從0.05～1.2 時的約登指數(shù)，圖2 為 1 種進口ELISA 試劑的臨界值從0.4～1.2 時的約登指數(shù)。表5 為各試劑在最大約登指數(shù)下的靈敏度和特異性和S/CO。從結(jié)果來看，兩種HBsAg 試劑的最佳臨界值分別為0.3 和0.2，另外6 種ELISA 試劑的最佳臨界值為1～1.2。

3 討論

圖1 7 種國產(chǎn)ELISA試劑不同臨界點（S/CO值）下的約登指數(shù)

圖2 1 種進口ELISA試劑不同臨界點（S/CO值）下的約登指數(shù)

表5 各試劑最大約登指數(shù)下的S/CO值及其靈敏度和特異性

據(jù)文獻報道，不同的試劑盒其包被抗原的來源、純度、包被工藝及包被量等都存在差異，使得不同的試劑盒對不同片段的抗原或抗體的反應(yīng)不同，同時加上不同方法學所受的干擾不同，從而出現(xiàn)不同的試劑盒對同一標本的測定結(jié)果有可能不同，導致實驗中不同的試劑篩查結(jié)果有差異[3]。

WHO 輸血傳播感染篩查策略明確指出血液檢測篩查方法應(yīng)具有較高的靈敏度和足夠的特異性，避免由于非特異結(jié)果給獻血者帶來不必要的淘汰。灰區(qū)設(shè)置應(yīng)本著必要及合理，不能過度的強調(diào)試劑靈敏度而忽略特異性，從而影響試驗的總體性能。再者，如今血液的采集和臨床供應(yīng)短缺已成為常態(tài)化，血液資源更顯得有限和寶貴，如果血站實驗室灰區(qū)設(shè)置不合理，勢必造成一定血液資源的浪費；也會造成獻血者流失[4]。

近年來，血站系統(tǒng)很多實驗室對所用試劑進行灰區(qū)設(shè)置的探討[5-9]，通過對灰區(qū)標本進行確證實驗和灰區(qū)獻血者進行追蹤，結(jié)論不盡相同。我們實驗室通過對血清盤結(jié)果進行分析，比較設(shè)置灰區(qū)和不設(shè)灰區(qū)兩種情況下八種ELISA 試劑的靈敏度、特異性和約登指數(shù)。

血清盤的檢測結(jié)果表明，兩種HBsAg 試劑灰區(qū)設(shè)置為S/CO=0.7 時靈敏度為84.6%和79.4%，特異性為95.7%和97.3%，不設(shè)灰區(qū)時為S/CO=1時靈敏度為82.3%和76.8%，特異性為97.9%和98.4%。我們所用兩種HBsAg 試劑對血清盤的檢測中均存在一定比例的假陰性標本?？?HCV 試劑1和試劑2 灰區(qū)設(shè)置為S/CO=0.7 時靈敏度為99.7和99.1%，特異性為88.4%和92.9%，臨界值S/CO=1 時靈敏度為99.7%和99.7%，特異性為92.9%和93.5%。不設(shè)置灰區(qū)時靈敏度和特異性相比設(shè)置灰區(qū)時靈敏度和特異性有所提高。HIV 試劑1 和試劑2 灰區(qū)設(shè)置為S/CO=0.7 時和不設(shè)灰區(qū)時為S/CO=1時靈敏度是一致的，特異度在S/CO=1 時有所提高，特別是HIV 試劑2 的靈敏度為100%，特異性在取消灰區(qū)設(shè)置后為92.3%。HIV 試劑1 的特異性在取消灰區(qū)設(shè)置后也提高到97.4%?？?TP 試劑1和試劑2 的靈敏度和特異性灰區(qū)存在與否時基本一致，靈敏度為99.7%，特異性為82.8%~88.2%，存在一定的假陽性標本，且大部分假陽性標本的S/CO＞1。由此可知，HBsAg 試劑有必要設(shè)置灰區(qū)，并需要提高試劑的靈敏度，而抗-HCV、HIV 和抗-TP ELISA 試劑取消灰區(qū)設(shè)置。

本文參照文獻[10]中的方法，計算在不同S/CO值下試劑的靈敏度、 特異性及約登指數(shù)，約登指數(shù)=（靈敏度+特異度）-1，以 S/CO 值為橫坐標，約登指數(shù)為縱坐標，繪制曲線，觀察每種試劑在最大約登指數(shù)下的S/CO 值。8 種ELISA 試劑最佳臨界值分別為 HBsAg 試劑的最佳臨界值為0.2~0.3，抗-HCV 試劑的最佳臨界值為1，HIV 試劑的最佳臨界值為1~1.2，抗-TP 試劑的最佳臨界值為1~1.1。這與文獻[10-14]中的結(jié)果基本一致，國產(chǎn)HBsAg ELISA 試劑的陽性判定值為0.3，進口試劑設(shè)為0.6。11 家血站實驗室的抗-TP ELISA 試劑的結(jié)果支持取消灰區(qū)設(shè)置；關(guān)于抗-HCV 試劑灰區(qū)設(shè)置的近三年的文獻支持取消灰區(qū)設(shè)置； 對HIV 近五年灰區(qū)標本的分析結(jié)果也支持取消灰區(qū)設(shè)置。

京津冀[15]15 家血站實驗室ELISA 灰區(qū)設(shè)定調(diào)查結(jié)果顯示，除1 家血液中心，其他實驗室均設(shè)置了 ELISA 檢測灰區(qū)，主要集中在 0.7~0.85 之間。筆者認為ELISA 灰區(qū)是實驗室為更大限度檢測出陽性標本而設(shè)定的，它能夠降低因漏檢而帶來的風險，但也不可避免地淘汰一部分合格的血液。再者，ELISA 方法出現(xiàn)灰區(qū)除了病毒窗口期的原因還有很多因素，例如：病毒基因變異、鉤狀效應(yīng)、試劑因素、人為因素[16]。

綜上，灰區(qū)設(shè)置應(yīng)遵循科學性、嚴謹性和系統(tǒng)性。本文主要對血清盤的結(jié)果進行灰區(qū)設(shè)置合理性的分析，目前我們實驗室針對HBsAg 血清盤的結(jié)果做了詳細分析[17]，結(jié)果和本文一致。還需要補充無償獻血者的樣本的結(jié)果分析，下一步會進行確證實驗和結(jié)果分析，進一步探討ELISA 灰區(qū)設(shè)置的意義。