卜新雅，陳露，闞玉賀，雷華軍，何裕建，封祿田?，吳麗?

(1 沈陽化工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)學(xué)院， 沈陽 110142； 2 中國科學(xué)院大學(xué)化學(xué)科學(xué)學(xué)院， 北京 100049； 3 武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院， 武漢 430072)(2019年8月23日收稿； 2019年9月17日收修改稿)

手性是生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域中熱點(diǎn)問題之一[1-2]。DNA作為生命體中重要的遺傳物質(zhì)，通過轉(zhuǎn)錄合成mRNA 進(jìn)而控制氨基酸合成蛋白質(zhì)[3]。而氨基酸作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，廣泛存在于生命體內(nèi)。在20種組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸當(dāng)中，構(gòu)成蛋白質(zhì)的天然氨基酸為L構(gòu)型(L-AAs)，這確保了蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)達(dá)到預(yù)期的功能[4]。非天然的D型氨基酸(D-AAs)雖然不是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元,但在許多植物、微生物甚至是人體中都有存在。這些D-AAs主要是L-AAs的非生物酶的外消旋產(chǎn)物或由其他D-AAs的氨基轉(zhuǎn)移酶合成的產(chǎn)物獲得的[5-6]。DNA聚合反應(yīng)在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行，來自水生嗜熱桿菌的DNA聚合酶I[7](Taq-DNA聚合酶)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的生物技術(shù)中起著重要作用[8-9]。

D-氨基酸體外來源有服用一些藥物和日常食物含有的D-氨基酸，某些藥物如由微生物制得的某些抗生素就會有D-纈氨酸、D-絲氨酸等[10]，也有些藥物如利尿藥、低血糖、低血鈣藥物能抑制D-氨基酸氧化酶的合成，使體內(nèi)D-氨基酸水平增加。

D氨基酸對人體的影響一直有所爭議，D-AAs通常在羊水或腦脊液中含量最低(低于相應(yīng)的L-AAs的1%)。而尿液中含量最高(通常為10%以下)[11]。D-天冬氨酸(Asp)和D-絲氨酸(Ser)殘基在不同的衰老組織中均有特異性檢測；例如，在視網(wǎng)膜、結(jié)膜、角膜[12-13]、牙齒、骨骼[14]、動脈壁、韌帶、大腦[15]、皮膚[16]中都發(fā)現(xiàn)了D-Asp殘基，而在大腦中也發(fā)現(xiàn)了D-Ser殘基[17-18]。人眼因D氨基酸含量增多而失去光澤甚至病變；在老年癡呆的人的大腦中發(fā)現(xiàn)D氨基酸的含量增加[19]；據(jù)報道D-谷氨酸濃度的增加會對酵母細(xì)胞的生長產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用[20]。但也有研究發(fā)現(xiàn)添加D-氨基酸混合物可提高乳酸鏈球菌的耐酸能力，提高乳酸鏈球菌內(nèi)酯的產(chǎn)率[21]；在皮膚屏障功能受損時，促進(jìn)細(xì)胞間脂質(zhì)的生成，加快屏障功能恢復(fù)。在真皮纖維母細(xì)胞(FB)中，D-天冬氨酸能夠減輕因自由基產(chǎn)生源的增加而引起的氧化毒性。另外，D-蛋氨酸亦顯示出對于 FB 的 紫外線損傷有抑制效果。D-氨基酸目前已被應(yīng)用至護(hù)膚品當(dāng)中[22]。游離型D-絲氨酸局部存在于成熟哺乳動物的前腦(大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)等)，與神經(jīng)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)有關(guān)[23-25]。

Taq-DNA聚合酶由于其優(yōu)異的熱穩(wěn)定性是PCR中常用酶之一。金屬離子如Ca2+、Ni2+、Cr3+已被報道影響DNA聚合酶的活性[26-27]。鐵鈷(II)單、雙鏈小分子螯合物抑制轉(zhuǎn)錄過程的發(fā)生[28]。環(huán)烯醚萜、馬鞭草苷及其衍生物對Taq-DNA聚合酶有抑制作用[29]。還有一些抑制劑包括雙脫氧核苷酸、磷脂、脂肪酸、類黃酮、三萜類、喜樹堿、花青素和橢圓苷類已被用于臨床試驗(yàn)[30-33]。 但目前手性氨基酸及其與金屬離子配合物對DNA聚合反應(yīng)的影響仍未見報道。

本文是在Taq-DNA聚合酶作用下進(jìn)行的DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)，同時加入手性氨基酸、手性氨基酸與金屬離子共混液、金屬離子等，改變DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)體系的反應(yīng)環(huán)境。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳將產(chǎn)物進(jìn)行分離，使用Image Lab軟件進(jìn)行條帶含量分析，通過分析反應(yīng)條帶百分比和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平驗(yàn)證確定手性氨基酸等因素對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響。同時進(jìn)行手性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)影響的時間動力學(xué)分析、手性氨基酸與金屬離子的共同作用等實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證手性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響情況。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用的藥品是分析純。所有溶液用超純水配制。DL-丙氨酸(DL-Ala)，DL-纈氨酸(DL-Val)等手性氨基酸均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。氯化鈉(NaCl)、氯化鋁(AlCl3)、氯化鉀(KCl)、氯化鈣(CaCl2)等金屬鹽購于北京化工廠。dNTP、轉(zhuǎn)錄模板鏈和5′-FAM 標(biāo)記引物訂購于上海生工生物股份有限公司。Taq DNA 聚合酶及10×Taq Buffer購于北京天根生化科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

儀器使用Thermo Nano DropTMOne超微量紫外分光光度計(jì)、Bio-Rad Chemi Doc XRS 高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、Bio-Rad 凝膠電泳儀及PCR儀。

1.3 手性氨基酸濃度的確定

手性氨基酸溶液均由超純水配制成50 mmol/L水溶液，使用Thermo Nano Drop超微量紫外分光光度計(jì)全波長(200～900 nm)掃描確定手性氨基酸的紫外吸收峰強(qiáng)度。由測量結(jié)果(表1)可知，同種手性氨基酸的吸收強(qiáng)度基本一致，即DL兩種構(gòu)型氨基酸濃度相同，符合實(shí)驗(yàn)條件。20種氨基酸在可見光區(qū)域均無光吸收，在近紫外區(qū)只有3種氨基酸有光吸收能力，這3種氨基酸是苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Try)，因?yàn)樗鼈兊腞基含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)。

表1 手性氨基酸(50 mmol/L)超微量全波長掃描表Table 1 Chiral amino acid (50 mmol/L) ultra-micro full-wavelength scanning table

1.4 手性氨基酸影響下的DNA引物延伸

1.5 DNA引物延伸時間動力學(xué)測定

與手性氨基酸影響下的DNA引物延伸實(shí)驗(yàn)類似，加入Taq DNA聚合酶在55 ℃恒溫孵育后，分別在0、5、10、15、20、25、30 min時間點(diǎn)進(jìn)行取樣。將樣品加入同等體積的緩沖液混合均勻后放入-20 ℃冰箱內(nèi)，確保停止反應(yīng)。取4 μL反應(yīng)溶液加入至20%變性聚丙烯酰胺凝膠泳道中，進(jìn)行150 V電泳1 h。通過化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀進(jìn)行成像，使用Image Lab軟件進(jìn)行條帶分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 非極性手性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響

非極性氨基酸共有9種，其中非極性脂肪族R基氨基酸有甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)；非極性芳香族R基氨基酸有苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Try)。除甘氨酸無手性對映體外，其余氨基酸均有D、L兩種手性構(gòu)型。選取丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選取重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次結(jié)果作圖，并計(jì)算氨基酸與空白組及手性氨基酸D、L構(gòu)型之間的顯著性水平(P-Value)。其中10 mmol/L非極性手性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)30 min條件下的影響結(jié)果見圖1。

通過顯著性差異分析，顯著性水平P值越小，兩者差異性越顯著，一般認(rèn)為P≤0.05時差異有顯著性。從圖1可以看出L-苯丙氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的抑制作用大于其他非極性氨基酸，L-丙氨酸抑制作用次之，L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響不明顯。此外除D-色氨酸外，其余D構(gòu)型非極性氨基酸均不同程度地抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)，其中纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸的D構(gòu)型抑制作用大于其L構(gòu)型。

2.2 極性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響

極性氨基酸共有11種，分為極性不帶電荷(中性)氨基酸、極性帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸和極性帶正電荷(堿性)氨基酸。其中極性不帶電荷氨基酸有脯氨酸(Pro)、天冬酰胺(Asn)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)。通過實(shí)驗(yàn)得出極性不帶電荷氨基酸在10 mmol/L濃度下對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)30 min的影響見圖2。

從圖2中可以看出L-天冬酰胺對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)有一定抑制作用，其余L構(gòu)型氨基酸基本無影響。其對應(yīng)極性不帶電荷D構(gòu)型氨基酸與L構(gòu)型相比，均在不同程度上對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)起到促進(jìn)作用。

極性帶負(fù)電荷的氨基酸有天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；極性帶正電荷氨基酸有賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)。其中在極性帶電荷手性氨基酸濃度為10 mmol/L時對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)30 min的影響如圖3所示。

圖3 極性帶電荷手性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)產(chǎn)物影響Fig.3 The effect of polar charged chiral amino acids on the products of DNA chain polymerization

從圖3中可以看出，酸性氨基酸較堿性氨基酸抑制作用更明顯，并且谷氨酸的作用強(qiáng)于其他極性帶電荷氨基酸。極性帶正電荷氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)影響不明顯。

在極性帶電荷的氨基酸中，通過DL構(gòu)型對比可以發(fā)現(xiàn)，除谷氨酸外，其余極性帶電荷氨基酸的D構(gòu)型對DNA鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的負(fù)影響均大于L構(gòu)型。并且?guī)в胸?fù)電荷的天冬氨酸與谷氨酸的抑制作用大于帶有正電荷的賴氨酸、組氨酸、精氨酸。極性帶電荷與極性不帶電荷氨基酸相比，DL構(gòu)型的影響呈現(xiàn)出相反的趨勢。由于部分引物延伸過程未反應(yīng)完全，其質(zhì)量介于未反應(yīng)的17 bp及聚合反應(yīng)完全完成的25 bp雙鏈DNA之間。故17～25 bp之間存在其他條帶。

2.3 手性精氨酸及苯丙氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響時間動力學(xué)分析

精氨酸作為堿性氨基酸，是人體生長發(fā)育必不可少的氨基酸。能促使氨轉(zhuǎn)變成為尿素，從而降低血氨含量。從上述實(shí)驗(yàn)得知精氨酸會促進(jìn)DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的進(jìn)行。通過分析在0、5、10、15、20、25、30 min時間梯度的反應(yīng)情況，得到圖4。

圖4 手性精氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)影響的時間梯度反應(yīng)情況Fig.4 Time gradient reaction of the effect of chiral arginine on DNA chain polymerization

從圖4中可以看出，DNA結(jié)合速率是隨著時間的增加而逐漸降低的，并且手性影響差別規(guī)律明顯，呈現(xiàn)線性相關(guān)趨勢。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，D構(gòu)型的精氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的促進(jìn)作用小于其L構(gòu)型，符合之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果。精氨酸等帶正電荷的堿性氨基酸會促進(jìn)DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的進(jìn)行，而谷氨酸等帶負(fù)電荷的酸性氨基酸會輕微抑制。說明由于電荷作用，氨基酸對酶和核酸的結(jié)合產(chǎn)生一定的影響。

苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一，屬芳香族氨基酸。在體內(nèi)大部分經(jīng)苯丙氨酸羥化酶催化作用氧化成酪氨酸，并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素，參與機(jī)體糖代謝和脂肪代謝[34]。從上述實(shí)驗(yàn)得知苯丙氨酸會抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的進(jìn)行。手性苯丙氨酸在0、5、10、15、20、25、30 min時間梯度反應(yīng)情況見圖5。

由圖5苯丙氨酸動力學(xué)擬合曲線可知，作為抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的苯丙氨酸其動力學(xué)趨勢也與之前實(shí)驗(yàn)相符。苯丙氨酸抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)速率并且L-苯丙氨酸抑制作用較強(qiáng)于D-苯丙氨酸。

2.4 手性精氨酸及苯丙氨酸與金屬離子對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響

非極性的苯丙氨酸和極性的精氨酸分別對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)起到明顯的抑制和促進(jìn)作用，為了進(jìn)一步探究其在金屬離子存在條件下的影響，故加入手性精氨酸及其與NaCl、AlCl3、KCl、CaCl2、FeCl2、FeCl3、NiCl2、CuCl2、ZrCl4金屬鹽共混溶液進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖5 手性苯丙氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)影響的時間梯度反應(yīng)情況Fig.5 Time gradient reaction of the effect of chiral phenylalanine on DNA chain polymerization

圖6 手性精氨酸與金屬離子對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響Fig.6 The effect of chiral arginine and metal ions on DNA strand polymerization

從圖6可以看出，手性精氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)起促進(jìn)作用，并且在濃度為5 mmol/L金屬離子存在的情況下，這一特性及手性規(guī)律基本不變。精氨酸對Na+、Fe2+及Cu2+的促進(jìn)作用影響較大，對Al3+、Ni2+、Zr4+無明顯作用。精氨酸的加入改善了金屬離子對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響，并且在精氨酸與某些金屬鹽溶液共混過程中，發(fā)現(xiàn)其容易產(chǎn)生絡(luò)合物并析出。所以推測由于精氨酸與金屬離子發(fā)生相互作用，從而減弱了金屬離子對DNA或聚合酶的影響。

作為抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的苯丙氨酸，其含有芳香族R基團(tuán)。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，同樣加入其手性氨基酸與NaCl、AlCl3、KCl、CaCl2、FeCl2、FeCl3、NiCl2、CuCl2、ZrCl4金屬鹽共混溶液進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，通過變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行條帶分離并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

圖7 手性苯丙氨酸與金屬離子對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)影響Fig.7 The effect of chiral phenylalanine and metal ions on DNA strand polymerization

從圖7可以看出，手性苯丙氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)起抑制作用，但在金屬離子存在的情況下，其抑制程度發(fā)生變化。苯丙氨酸與Na+、Cu2+共同作用時會較單獨(dú)加入金屬離子時起到輕微促進(jìn)的作用。苯丙氨酸與Ca2+、Fe2+協(xié)同對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)抑制較大。手性苯丙氨酸對Al3+、Zr4+幾乎完全抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響無明顯改變。

3 結(jié)論

手性氨基酸中D構(gòu)型與L構(gòu)型對于DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響并不完全一致，但不同種類氨基酸對其影響呈現(xiàn)一定的規(guī)律。非極性氨基酸中除苯丙氨酸抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)外其余氨基酸對其影響不大。極性不帶電荷氨基酸整體對鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)無明顯影響，但其存在D構(gòu)型氨基酸的反應(yīng)速率均大于L構(gòu)型氨基酸。極性帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)起到輕微抑制作用，極性帶正電荷(堿性)氨基酸對于鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)一定程度上起到促進(jìn)作用。Na+、K+、Ca2+等9種金屬離子及與手性氨基酸共同作用中，鋁鹽及鋯鹽溶液對PCR實(shí)驗(yàn)幾乎完全抑制；鎳、銅、鈣對其影響次之。手性氨基酸與金屬離子協(xié)同作用會在一定程度上促進(jìn)或抑制其單獨(dú)作用于DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)，并且保持一定的手性影響規(guī)律。