吳 云 安亦軍 齊志群 李 威 田小軍 吳趙勇 栗紹剛

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院熱帶醫(yī)學(xué)研究所，北京 100050；2.北京熱帶病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

內(nèi)臟利什曼病是由利什曼原蟲(chóng)寄生于人體引起的疾病，根據(jù)傳染源不同，我國(guó)的內(nèi)臟利什曼病主要分為人源型、犬源型和自然疫源型(張鵬等，2019)，人源型主要分布在蘇北、皖南、鄂北、豫東、冀南、陜西關(guān)中和新疆南部等地區(qū)，患者為主要傳染源；犬源型主要分布于甘肅、青海、寧夏、川北、陜北、冀東北、遼寧和北京市郊的山丘地區(qū)，病犬為主要傳染源；自然疫源型主要分布于新疆以及內(nèi)蒙等荒漠地區(qū)，某些野生動(dòng)物為主要傳染源 。隨著國(guó)家對(duì)利什曼病的重視及控制，我國(guó)多數(shù)地區(qū)利什曼病已經(jīng)得到控制，目前病例主要分布在新疆、四川、甘肅、陜西、山西、河南和內(nèi)蒙古等地(鄭燦軍等，2017)。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院就診的內(nèi)臟利什曼患者多數(shù)來(lái)自于山西及其交界的陜西、河北等地區(qū)，以往的研究顯示山西省以嬰兒利什曼原蟲(chóng)感染為主(Luetal.，1994；汪俊云等，1996)，近些年，隨著人口流動(dòng)性的增加，山西及周邊地區(qū)感染內(nèi)臟利什曼的蟲(chóng)種類型以及基因多樣性是否有變化需要進(jìn)一步的研究。

核糖體小亞基rRNA 基因(small subunit ribosomal rRNA, SSU rRNA)是真核生物一個(gè)較為保守的基因，在原蟲(chóng)的種間變異較大，可用于利什曼原蟲(chóng)種屬之間親緣關(guān)系的研究 (曹得萍等，2013)。核糖體的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)I(internal transcribed spacer I, ITS-1)是核糖體DNA中介于18 S-5.8 S之間的序列，該區(qū)域進(jìn)化速度快，利什曼原蟲(chóng)種間表現(xiàn)出廣泛的序列多態(tài)性，可用于利什曼原蟲(chóng)的分類鑒定(趙桂華等，2010；劉東立等，2018)。本研究使用PCR方法擴(kuò)增來(lái)自山西及周邊地區(qū)內(nèi)臟利什曼病患者感染利什曼原蟲(chóng)的SSU rRNA 和ITS-1序列并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與利什曼原蟲(chóng)不同種以及同一個(gè)種不同分離地的蟲(chóng)株的SSU rRNA 和ITS-1序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以明確山西及周邊地區(qū)感染的利什曼原蟲(chóng)蟲(chóng)種類型及遺傳多樣性特征。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本項(xiàng)研究使用的13例內(nèi)臟利什曼病患者的骨髓樣本來(lái)自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院2019年3月至2020年5月的住院患者,其中10例患者來(lái)自山西省(陽(yáng)泉市7例、臨汾市1例、平定縣1例、山西省不能確定具體感染地1例)，3例患者來(lái)自周邊地區(qū)(陜西渭南市1例、甘肅隴南市1例、河北邢臺(tái)市1例)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)使用的利什曼原蟲(chóng)不同種以及同一個(gè)種不同來(lái)源地的SSU rRNA和ITS-1序列來(lái)自GenBank(表1)。

表1 利什曼原蟲(chóng)蟲(chóng)株及其國(guó)際編碼和來(lái)源地Tab.1 Leishmania isolates and their international codes, isolated places

1.2 主要試劑和儀器

試劑：磁珠法通用型基因組DNA提取試劑盒(DP705,天根生化科技有限公司)；GoTaq Green Master Mix(M7123, Promega)。儀器：ProFlexTMPCR系統(tǒng)。

1.3 骨髓樣本DNA提取

參照天根生化科技有限公司的DNA提取試劑盒(DP705)操作說(shuō)明書(shū)提取。

1.4 SSU rRNA和ITS-1基因擴(kuò)增、測(cè)序及同源性分析

擴(kuò)增SSU rRNA使用的引物為R222(5′-TATTGGAGATTATGGAGCTG-3′)和R333(5′-AAAGCGGGCGCGCGGTGCTG-3′)(曾得萍等，2014)，PCR反應(yīng)條件95℃2min；95℃30s，58℃30s，72℃15s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。擴(kuò)增ITS-1使用的引物為L(zhǎng)ITSR(5′-CTGGATCATTTTCCGATG-3′)和L5.8S(5′-TGATACCACTTATCGCAC-3′)(趙桂華等，2010)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，40 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程股份有限公司雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用ContigExpress軟件進(jìn)行拼接，使用MegAlign軟件進(jìn)行同源性分析。

表1續(xù) Tab.l Continued

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

使用本研究測(cè)序得到的13條SSU rRNA和13條ITS-1序列與GenBank下載的利什曼原蟲(chóng)不同種以及同一個(gè)種不同地區(qū)分離到的利什曼原蟲(chóng)的SSU rRNA基因序列(29條)和ITS-1基因序列(28條)，應(yīng)用MEGA 7.0 軟件中的Clustal W 法對(duì)全部序列進(jìn)行比對(duì)，使用neighbor-joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用Bootstraping 法對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 SSUrRNA和ITS-1基因序列比對(duì)結(jié)果

13個(gè)樣品的SSU rRNA和ITS-1序列同源性分別為99.59%(圖1)和99.93%(圖2)。將本研究的13條SSU rRNA基因序列以及GenBank下載的29條序列比對(duì)，同源性為85.8%～100%(圖3)；13條ITS-1序列以及GenBank下載的28條序列比對(duì)，同源性為66.2%～100%(圖4)。該結(jié)果表明ITS-1序列在利什曼原蟲(chóng)種間以及種內(nèi)蟲(chóng)株間變異度較SSU rRNA基因大，利什曼原蟲(chóng)的SSU rRNA基因相對(duì)更保守。

圖1 13例患者感染利什曼原蟲(chóng)蟲(chóng)株SSU rRNA基因的序列比對(duì)結(jié)果Fig.1 Sequence alignment of SSU rRNA gene of 13 patients infected with Leishmania strain

圖2 13例患者感染利什曼原蟲(chóng)蟲(chóng)株ITS-1序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Sequence alignment of ITS-1 sequences of 13 patients infected with Leishmania strain

圖3 利什曼原蟲(chóng)SSU rRNA序列同源性比較Fig.3 Homology of SSU rRNA genes of Leishmania

圖4 利什曼原蟲(chóng)ITS-1序列同源性比較Fig.4 Homology of ITS-1 sequences of Leishmania

2.2 基于SSU rRNA基因和ITS-1序列分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

基于SSU rRNA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)，結(jié)果顯示，13株患者感染蟲(chóng)株親緣關(guān)系較近，均聚到一個(gè)分支上，并與杜氏利什曼L.donovani、嬰兒利什曼L.infantum和恰氏利什曼L.chagasi聚到一個(gè)分支上，但不能更進(jìn)一步確定為哪一個(gè)蟲(chóng)種?；贗TS-1序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)，13株患者感染蟲(chóng)株均聚到一個(gè)分支上，與L.infantum聚到一個(gè)分支上，表明13株患者感染蟲(chóng)株均為L(zhǎng).infantum。

本研究在引入外群基因時(shí)納入了同時(shí)具有SSU rRNA基因和ITS-1序列的10個(gè)蟲(chóng)株，通過(guò)分析比較這10個(gè)蟲(chóng)株以及本研究使用的13個(gè)臨床樣本的序列，我們發(fā)現(xiàn)本研究使用的13個(gè)樣本不論是使用SSU rRNA基因還是ITS-1序列，都與甘肅分離到的原蟲(chóng)株MHOM/CN/93/GS7聚到一起(圖5，6)。MHOM/CN/80/XJ801(新疆)、MHOM/CN/83/GS2(甘肅)、MHOM/CN/90/SC10H2(四川)、MHOM/CN/84/SD1(山東)4個(gè)蟲(chóng)株基于SSU rRNA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，聚到一個(gè)小分支上；而基于ITS-1基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，4個(gè)蟲(chóng)株聚到一個(gè)相對(duì)大的分支上，大分支下又進(jìn)一步細(xì)分，MHOM/CN/83/GS2(甘肅)和MHOM/CN/84/SD1(山東)在一個(gè)分支上，表明親緣關(guān)系更近。MHOM/CN/80/XJ801(新疆)和MHOM/CN/90/SC10H2(四川)聚到一個(gè)分支上。因此，基于SSU rRNA基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建可以按照親緣關(guān)系遠(yuǎn)近分成大類，卻不能有效的區(qū)分不同的蟲(chóng)種(圖5)，使用ITS-1基因聚類可以進(jìn)行不同種的有效區(qū)分，并且可以進(jìn)一步在種內(nèi)進(jìn)行區(qū)分(圖6)。

圖6 基于ITS-1序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Construction of phylogenetic tree based on ITS-1 sequences

3 討論

山西省目前仍然是我國(guó)內(nèi)臟利什曼病的流行區(qū)，我院診斷的黑熱病有75%來(lái)自山西，以往的文獻(xiàn)報(bào)道山西省利什曼原蟲(chóng)感染患者多為犬源型，以嬰兒利什曼原蟲(chóng)為主。隨著近些年人口流動(dòng)性的增加，山西感染的利什曼原蟲(chóng)的蟲(chóng)株是否有變化以及其基因的多態(tài)性有待于進(jìn)一步研究。

本研究以我院收治的13例來(lái)自山西以及周邊地區(qū)的內(nèi)臟利什曼患者感染蟲(chóng)株的SSU rRNA和ITS-1序列進(jìn)行了測(cè)序并比對(duì)，13個(gè)患者感染蟲(chóng)株的SSU rRNA基因同源性達(dá)到了99.59%，ITS-1序列同源性為99.93%，表明13個(gè)患者感染蟲(chóng)株同源性很高，感染蟲(chóng)株可能為同一個(gè)種。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，從GenBank下載了利什曼原蟲(chóng)不同種以及同一個(gè)種不同蟲(chóng)株的SSU rRNA和ITS-1序列，基于SSU rRNA和ITS-1序列分別構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，不論使用SSU rRNA基因還是ITS-1基因，13個(gè)內(nèi)臟利什曼的感染蟲(chóng)株均聚到一個(gè)分支上，因此，13個(gè)患者的感染蟲(chóng)株屬于同一個(gè)種?；赟SU rRNA基因的聚類圖顯示13個(gè)患者的感染蟲(chóng)株與杜氏利什曼原蟲(chóng)，嬰兒利什曼原蟲(chóng)和恰氏利什曼原蟲(chóng)聚為一類(圖5)。L.infantum屬于L.donovani的亞種，親緣關(guān)系較近，使用SSU rRNA基因進(jìn)行分類L.infantum和L.donovani出現(xiàn)在同一個(gè)分支上的，并不能進(jìn)一步區(qū)分，因此，我們的研究結(jié)果也支持SSU rRNA基因更適用于高階元的系統(tǒng)發(fā)育研究這一結(jié)論(曹得萍等，2013)。

圖5 基于SSU rRNA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Construction of phylogenetic tree based on SSU rRNA gene sequences

目前報(bào)道的可用于利什曼蟲(chóng)種鑒定的序列有ITS序列(Charguietal.，2012)，細(xì)胞色素氧化酶基因(cytochrome-b gene，Cyt-b)(Hideetal.,2008)，表面糖蛋白63基因(Glycoprotein 63, GP63)(Victoiretal.，1998)，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)(Castilhoetal.，2003)，熱休克蛋白(heat shock protein, Hsp)(Fragaetal.，2013)等。本研究使用ITS-1序列進(jìn)行利什曼原蟲(chóng)蟲(chóng)種的鑒定，結(jié)果顯示ITS-1序列可有效的區(qū)分親緣關(guān)系較近的嬰兒利什曼原蟲(chóng)和杜氏利什曼原蟲(chóng)，可進(jìn)行亞種水平的鑒定，與報(bào)道的研究結(jié)論一致(劉東立等，2018；程芳洲等，2019)。此外，本研究引入了10個(gè)蟲(chóng)株同時(shí)具有SSU rRNA和ITS-1序列，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)SSU rRNA基因和ITS-1序列對(duì)這10個(gè)蟲(chóng)株的分類結(jié)果是一致的，本研究通過(guò)保守性更好的SSU rRNA基因進(jìn)一步驗(yàn)證了ITS-1序列分類的準(zhǔn)確性。研究的結(jié)果提示我國(guó)山西省內(nèi)臟利什曼病患者感染蟲(chóng)種以嬰兒利什曼原蟲(chóng)L.infantum為主，與以往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論一致(Luetal.，1994；汪俊云等，1996)，并且不同患者感染蟲(chóng)株的SSU rRNA基因和ITS-1序列同源性很高，感染蟲(chóng)株遺傳關(guān)系較近。