陳光輝 李 焱 張小菊 胡紅英

(1. 喀什大學生命與地理科學學院，新疆喀什 844000；2. 新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點實驗室，新疆喀什 844000；3. 新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊 830046；4.喀什海關技術中心，新疆喀什 844000 ；5.烏魯木齊海關技術中心，新疆烏魯木齊 830000)

紅棗的維生素含量非常高，具有滋陰補陽的功效，是天然的維生素，棗果甘甜可口，深受人們的喜愛。紅棗樹為溫帶作物，適應性強，具有耐旱、耐澇的特性，在我國廣泛種植，果實尤其以新疆紅棗最為甘甜。然而，研究表明棗咔實蠅CarpomyavesuvianaCosta對棗果危害嚴重，給紅棗產(chǎn)業(yè)帶來毀滅性打擊。棗咔實蠅是非常危險的重大檢疫性有害生物、在新疆乃至全國棗產(chǎn)業(yè)上有著重要經(jīng)濟意義的害蟲，該蟲在2007年被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》(吳恂等，2007；張潤志等，2007；阿地力·沙塔爾等，2008)。

棗咔實蠅隸屬于雙翅目(Diptera)、實蠅科(Tephritidae)、實蠅亞科(Trypetinae)、實蠅族(Trypetini)、咔實蠅屬Carpomya(張潤志等，2007)。該蟲已經(jīng)分布于印度、巴基斯坦、毛里求斯、阿富汗、泰國、烏茲別克斯坦、塔吉克斯坦、土庫曼斯坦、伊朗、俄羅斯、阿曼等國(Gyietal.，2003； Azametal.，2004；Farraretal.，2004；Sookaretal.，2006；阿地力·沙塔爾等，2008；胡隴生，2012)。該蟲主要以卵和幼蟲隨寄主果實、蛹隨土壤、苗木的調運傳播，主要危害棗屬的植物，如紅棗Ziziphusjujuba和酸棗Z．jujubavar．spinosa(Hancocketal.，1994；Farraretal.，2004)；成蟲將卵產(chǎn)于紅棗果實表面致使產(chǎn)卵部位果肉組織發(fā)育滯緩而形成缺陷，果面可形成斑點和蟲孔；幼蟲蛀食棗果內部果肉并形成蛀道導致棗果早熟和腐爛，不蛀食棗核和種仁；棗果被害率可高達60%～70%以上，產(chǎn)量損失可達20%以上，嚴重時棗果絕收(阿地力·沙塔爾等，2008)，給世界多地紅棗產(chǎn)業(yè)造成重大損失(Lakraetal.，1983；陳乃中，1998；Dashadetal.，1999；Stonehouseetal.，2002；Gyietal.，2003a)。阿地力·沙塔爾等(2008)首次報道了該蟲在我國新疆吐魯番地區(qū)的發(fā)生情況，與本文研究為同種但傳播來源不同；目前已對棗咔實蠅生物生態(tài)學特性、產(chǎn)卵選擇性及適生性進行研究(何善勇等，2009；胡隴生等，2012)。由于該蟲主要以幼蟲形式鉆蛀在棗果內取食，成蟲善于飛行，防治較為困難；化學農藥在一定程度上能夠起到防治效果(Singhetal.，2000；Gyietal.，2003a,b)，但不能根除，不是長久之計。因此，加強檢驗監(jiān)管，加強監(jiān)測早期預警，阻止該蟲傳播擴散是減少經(jīng)濟損失的有效方法。

棗咔實蠅的快速準確鑒定是監(jiān)測預警防控的基礎，在口岸一線及果園檢測預警對該蟲實現(xiàn)快速鑒定是減少和降低該蟲入侵風險和危害的重要屏障。目前，對于棗咔實蠅的鑒定依賴于的形態(tài)特征，該蟲的蛹、成蟲近似種樣本均很難辨認，不能快速實現(xiàn)準確鑒定，嚴重影響預測預警和后期防治，以分子生物學技術為基礎的DNA條形碼技術能夠解決此類問題(馬英等，2012)。

物種DNA分子鑒定是由Tautz等(2002)、Hebert等(2003a,b)和Ward等(2005)提出，利用DNA序列的保守性和變異性對多個物種進行了分類鑒定。利用分子生物學手段，結合生物信息學分析和信息提交等步驟(楊倩倩等，2012；陳光輝等，2018)，發(fā)現(xiàn)具有足夠變異的標準化短基因片段(兼具保守性和變異性)來區(qū)分物種(劉慎思，2012)。目前在昆蟲線粒體基因中，常選用COI、COII、16SRNA鑒定物種(郭玉燕等，2017)，多數(shù)物種的COI序列的種內遺傳距離大多小于2%，而種間遺傳差異相對較高(Hebertetal.，2003；Wardetal.，2005；Folmeretal.，2006; Hajibabaeietal.，2006；張媛等，2011)，能夠廣泛用于動物種及種群研究。由于ITS2等序列選擇壓力小，變異較大，種內遺傳差異相對其他基因較高，適合物種及其種群的研究(黃華平等，2006)。關于棗咔實蠅DNA條形碼基因發(fā)掘較少，有待進一步豐富。

在DNA條形碼鑒定時，經(jīng)常出現(xiàn)某個基因擴增不出的情況，對多個條形碼進行研究，實現(xiàn)快速鑒定非常有必要。本研究旨在對棗咔實蠅進行DNA條形碼研究，克服傳統(tǒng)形態(tài)分類學鑒定方法存在的不足，充分挖掘棗咔實蠅多個分子鑒定靶點，獲得相關基因分子數(shù)據(jù)，作為形態(tài)學特征的補充，實現(xiàn)不同樣品狀態(tài)的快速鑒定，為該蟲快速鑒定、早期防治提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要設備

體視顯微鏡(Motic Cam2506 SMZ168)、 PCR 儀(Biometra TProfessional standard Gradient Thermocycler)、高速低溫離心機(Beckman CoulterTMAllegraTMX-22R Centrifuge)、制冰機(SANYO Ice Maker SIM-F140AY65)、電泳儀(JY1600C)、水平電泳槽(美國 Bio-Rad)、凝膠成像儀(BioRad Molecular Imager Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng))、振蕩器(IKA MS3 digital)和恒溫水浴鍋等。

1.2 標本采集和保存

2018年7～8月從喀什海關旅客攜帶物中截獲該蟲標本。將蛹至于含有潮濕沙土的50 mL離心管中，紗布用皮筋箍緊離心管口，在室溫下將蛹孵化并收集成蟲。觀察蛹和成蟲樣品外觀形態(tài)。將該蟲蛹和成蟲整理后保存于含有99%酒精的離心管中，并放置于冰箱4 ℃冷藏保存，做為DNA提取材料。

1.3 基因組 DNA 提取和PCR 擴增

1.3.1基因組 DNA 的提?。簶悠稤NA采用天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取，具體操作步驟見試劑盒(Cat.#DP304-02, RT(15-20 ℃))說明書。

1.3.2基因片段PCR 擴增：引物由上海生工合成，具體引物序列及參考文獻如表1所示。擴增體系總體積為25 μL，包括1.5 U Taq酶，0.25 mmol/L dNTP，1×反應緩沖液，2.0 mmol/L Mg2+，上下游引物各為通用引物0.3 μmol/L，DNA 模板50 ng。反應程序為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性 45 s，45(55)℃退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，循環(huán) 40次；最后 72 ℃延伸 7 min。PCR產(chǎn)物送至安徽通用生物技術公司進行測序(雙脫氧法)。

表1 PCR 擴增引物及其參考文獻Tab.1 PCR primer designed and the reference cited

1.4 序列數(shù)據(jù)處理及分子系統(tǒng)樹構建

用 Dnastar Package 中的Editseq軟件進行正反鏈拼接匹配校正測序獲得的基因序列。在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上運行 BLAST程序進行序列相似性比較，確定所獲得的序列是否是昆蟲的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII基因序列。根據(jù)相似度和種內遺傳距離對樣品進行分子鑒定。結合從GenBank 中比對的與所獲得的ITS2、12SrRNA、16SrRNA、CYT-B-D、COI-5′、COI-3′、COII序列相似性較高的該蟲的相關序列，用ClustalX1.83軟件比對，非保守區(qū)域去除。用分子進化遺傳分析軟件MEGA6.0(Kumaretal.，2004；金倩等，2013)分析各物種間DNA序列的差異，基于 Kimura-2-Parameter模型，用鄰近法(NJ, Neighbour-Jioning)構建分子系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹各分支以1 000次循環(huán)估計系統(tǒng)樹中節(jié)點的自舉置信水平(Bootstrap confidence level，BCL)的重復檢驗(褚棟等，2005; 林麗莉等，2010)。

2 結果

2.1 棗咔實蠅形態(tài)學鑒定

棗咔實蠅的分類地位已經(jīng)明確，屬于完全變態(tài)昆蟲，可分為卵、幼蟲、蛹、成蟲4個發(fā)育形態(tài)，其形態(tài)特征如表2所示。

表2 棗咔實蠅形態(tài)特征Tab.2 Morphological characteristics of Carpomya vesuviana

2.2 分子鑒定結果

測序獲得了該蟲蛹和成蟲樣品ITS2、12SrRNA、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII基因的部分序列，依據(jù)表3中在NCBI數(shù)據(jù)庫中查閱的相關序列的覆蓋度、相似度最高的GenBank No.等信息進行鑒定。覆蓋度較低，且序列相似度低于種內遺傳距離的補數(shù)時，確定為新的條形碼序列；表明數(shù)據(jù)庫中未檢索到相關相似序列，核酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相關序列相似度較低，確定為該蟲樣品的新序列。本文獲得的棗咔實蠅核酸序列較多，共獲得16條，其中COI-5′基因2條為已有報道的鑒定序列，在BOLD中被鑒定為：棗咔實蠅Carpomyavesuviana，BIN ID:BOLD:ACH5208；其余14條在NCBI中未能鑒定出，為未見報道的新序列。

表3 NCBI比對結果Tab.3 NCBI Blast results

2.3 ITS1、ITS2、CYT-B、COI堿基含量統(tǒng)計

將所測序列進行拼接校對，在NCBI 網(wǎng)站上運行BLAST 程序可以確定測得序列為昆蟲的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII基因序列。通過與 GenBank中的相關序列進行比較，結合 GenBank 中下載的與該相應序列相似性較高的棗咔實蠅的序列，用 ClustalX1.83 軟件進行比對，將非保守區(qū)域去除，測序拼接后僅以表4中的序列長度進行分析。通過DNAman軟件分析本文所獲得的各個基因序列所有位點中AT堿基含量和GC堿基含量如表4所示。序列堿基含量統(tǒng)計分析結果表明，所測樣品線粒體基因，如COI、Cytb，AT/GC 含量相比，AT顯著高于GC，結果符合昆蟲線粒體基因AT堿基偏嗜特性。

表4 核苷酸使用頻率統(tǒng)計Tab.4 Nucleotides frequency statistics

2.4 系統(tǒng)進化樹構建與分析

將獲得的該蟲蛹和成蟲樣本的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII序列在NCBI中進行比對，可獲得得分高低和相似度高低排列表，結合GenBank 中下載與該蟲相應序列相似性較高的相關序列，用 ClustalX1.83 軟件去除相似性較差區(qū)域，用MEGA6.0構建該蟲科部分屬種ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、COI-5′、COI-3′、COII相關序列的NJ系統(tǒng)樹。系統(tǒng)樹分析表明，該蟲相關序列與所屬更高階元的某些種類較為親近，說明該類序列是該蟲相關序列，同時通過聚類不同序列反應得出了相應親緣關系。

3 討論

3.1 分子鑒定的基礎

DNA條形碼技術克服了形態(tài)學鑒定在實際應用中的諸多局限，彌補了傳統(tǒng)的昆蟲鑒定方法的不足之處，為種類鑒定提供了簡單快速準確的鑒定方法，同時為分類學家鑒定和發(fā)現(xiàn)復合組(體)、種團和近緣種提供了新方法。雖然形態(tài)學鑒定在實際應用中存在諸多局限，但是脫離了形態(tài)分類，以引物檢索設計為基礎的DNA條形碼技術將無法進行，即形態(tài)分類的大致類群是設計和檢索擴增DNA條形碼序列引物的基礎。因此利用分類學特征(外在形態(tài)特征，如形狀、大小、顏色等)對物種進行初步鑒定后，再結合DNA條形碼鑒定是更加高效準確的鑒定方法。

3.2 引物與序列分析

檢索并設計特異性引物是獲得目標核酸片段的基礎。本研究中檢索或設計的CYT-B、COI基因引物為每個基因2對，均能實現(xiàn)有效擴增，表明這4對引物都可以用來對該物種進行快速鑒定，不同長度(CYT-B)不同部位(COI)攜帶的信息量不同，但都能用于該物種的快速鑒定。

核酸使用率統(tǒng)計表明，ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII基因序列的AT含量明顯高于GC含量，表現(xiàn)明顯的A+T堿基偏嗜，且A與T含量相當，符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征。對本文所獲得的各個基因序列分析表明，這些基因序列均能在分子水平上對棗咔實蠅進行檢測分析。

雖然未找到多個基因的相似序列，但本文中棗咔實蠅蛹和成蟲樣品的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII序列分別均為單個同一樣品蛹或成蟲中獲得，在COI-5′獲得鑒定結果以后，可有確定他們都為該蟲的新序列。在COI獲得鑒定結果以后，其他序列也是從該昆蟲樣品中獲得序列，因此獲得了多條其他條形碼序列，且獲得的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII新序列較多。

3.3 分子鑒定結果

在NCBI 網(wǎng)站上運行BLAST程序，鑒定結果如表3所示，COI-5′、COI-3′基因相似度大于98%，能夠實現(xiàn)準確鑒定；依據(jù)COI-5′基因，棗咔實蠅蛹和成蟲樣品在BOLD中被鑒定為：棗咔實蠅Carpomyavesuviana，BIN ID:BOLD:ACH5208。通過表3中ITS2、CYT-B-C、CYT-B-D、COII基因比對數(shù)據(jù)分析可知，相似性較低，通過COI-5′基因已經(jīng)證明為棗咔實蠅樣品，通過相關基因且未能識別為棗咔實蠅樣品，說明棗咔實蠅的該類基因核酸數(shù)據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫中較少。數(shù)據(jù)庫中無相似數(shù)據(jù)，說明該核酸序列為新序列，新的核酸序列經(jīng)常出現(xiàn)，說明數(shù)據(jù)庫中該物種的序列不夠豐富(如文中COII等)，基因序列相似度較低，無法實現(xiàn)快速鑒定。

在對昆蟲進行分子鑒定時，新核酸序列、首次分子數(shù)據(jù)傳入的重要性等情況需要悉知。未經(jīng)過權威形態(tài)鑒定，將首次獲得核酸序列傳入數(shù)據(jù)庫中，造成后續(xù)研究者錯誤比對鑒定錯的情況是存在的，因此首次提供的分子數(shù)據(jù)對標本進行準確形態(tài)鑒定是非常重要的，這樣獲得的分子數(shù)據(jù)才會對后續(xù)的分子鑒定有指導意義。

3.4 系統(tǒng)進化樹構建

從分子系統(tǒng)樹可以看出，本實驗樣品的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、COI-5′、COI-3′、COII序列均和昆蟲相關序列具有很高的相似性，并且和已知的該蟲或相近種屬相關序列以較高置信值聚在一起，數(shù)據(jù)比對和建樹聚合結果均顯示該類樣品基因序列可從分子水平對該蟲進行分析鑒定。

數(shù)據(jù)庫信息數(shù)據(jù)量在分子系統(tǒng)學中的重要地位。CYT-B-C、CYT-B-D為CYT-B不同長度對比，通過表3中CYT-B-C、CYT-B-D相似度、覆蓋度數(shù)據(jù)和NJ系統(tǒng)進化樹(CYT-B-C未構建)分析可知，CYT-B-C雖然核酸序列信息豐富，但是數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)相對缺乏，不能充分發(fā)揮利用該基因的鑒定效果；CYT-B-D核酸序列信息較CYT-B-C相對少了很多，但系統(tǒng)進化鑒定指示信息明確，這說明一定長度的核酸序列已經(jīng)還有了足夠能夠鑒定物種的數(shù)據(jù)；由于數(shù)據(jù)庫中CYT-B-D核酸序列信息豐富，能夠將該蟲的CYT-B-D基因序列聚為一簇，發(fā)揮了較好的鑒定適用性，這說明數(shù)據(jù)庫中該類數(shù)據(jù)量越豐富越有利于物種鑒定。

不同基因適用于不同階元的分類研究。從ITS2、CYT-B-C、CYT-B-D、COII、COI-5′、COI-3′基因和序列NJ系統(tǒng)樹可以看出，該類昆蟲能將種階元的樣品聚在成一簇，說明該類基因適用于該類昆蟲分種研究。通過圖2中多個基因 NJ系統(tǒng)進化樹分析可知，該類棗咔實蠅樣本的多個基因序列與Rhagoletis親緣關系較近。從16SrRNA基因NJ系統(tǒng)樹可以看出，該類昆蟲屬及以上階元聚為一簇，說明該類基因可以用于鑒定該類昆蟲屬及以上階元的分類研究。

圖2 棗咔實蠅種類鑒定靶標序列的NJ 分子系統(tǒng)樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of identical sequences from related species of Carpomya vesuviana圖中數(shù)字表示置信度；本文的樣本用實心三角標出. A: ITS2; B: COI-5′; C: COI-3′; D: COII; E: 12S rRNA; F: 16S rRNA; G: CYT-B-D.Integer indicates bootstrap confidence values，and samples in this study were marked in solid triangle. A: ITS2; B: COI-5′; C: COI-3′; D: COII; E: 12S rRNA; F: 16S rRNA; G: CYT-B-D.

可以通過種群關系推斷害蟲傳播路徑。通過圖2-C與棗咔實蠅相關的部分種類的COI-3′基因 NJ 分子系統(tǒng)樹可以說明，本研究截獲的棗咔實蠅樣本與北疆的樣本關系較遠，與來自伊朗的實蠅樣本親緣關系較近，與阿地力·沙塔爾(2008)的研究結果中的KSS樣本較為一致，提示KSS樣本不是從吐魯番傳入南疆，可能是從伊朗或者其他的路線侵入我國，需要加強監(jiān)測預警，警惕傳入和擴散風險。

本研究利用DNA分子鑒定技術，結合形態(tài)學分類方法，通過提取該蟲DNA，檢索適用于該蟲相關基因擴增的引物進行PCR擴增并測序，獲得了棗咔實蠅的ITS2、16SrRNA、CYT-B-D、CYT-B-C、COI-5′、COI-3′、COII的序列，序列比對和NJ樹分析表明這些序列都可作為該蟲DNA分子鑒定靶點；對于某些適合種群演變關系研究的基因，如COI不僅能夠對種就行有效鑒別，而且可以對種群親緣關系遠近進行分析，為種群入侵或傳播途徑提供依據(jù)；該研究獲得的DNA分子特征,豐富了文中該蟲基因序列的數(shù)據(jù)庫，為快速鑒定提供多條新的參考序列，為該蟲快速鑒定、預警防控和早期防治提供基礎數(shù)據(jù)。