李芳芳 翁亞麗 李響 王茜 浦立勇 劉凌翔 楊芬 孫阿雷

亞洲尤其是在我國，70%～90%的肝癌是因乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的[1]。而甲胎蛋白(alpha -fetoprotein，AFP)、α-L-巖藻糖苷酶、異常凝血酶原等基于血清的分子標(biāo)志物檢測，其效能尚不能滿足臨床需求。在健康狀態(tài)下血液中的糖蛋白上連接的寡糖結(jié)構(gòu)是相當(dāng)穩(wěn)定的，各寡糖的相對含量也基本固定。肝癌發(fā)生時，肝臟的糖蛋白合成代謝將會有所改變，表現(xiàn)在寡糖結(jié)構(gòu)和含量上的變化[2]。本研究通過檢測肝癌組和非肝癌對照組中血清糖蛋白的寡糖鏈組分的相對濃度，研究其與肝癌的相關(guān)性，評價寡糖鏈檢測(Glycan-Test，G-Test)用于診斷HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌(HCC)的臨床價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2017年2月至2018年8月就診于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院435名受試者的血清及相關(guān)資料，共分為五組，其中健康對照組(healthy controls ，HC)80例、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)組105 例、乙型肝炎肝硬化(liver cirrhosis ，LC)組60例、其他器官惡性腫瘤組70例，HCC組120例。HCC組的病理診斷基于《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)》，臨床診斷主要依據(jù)血清AFP水平、肝臟超聲(ultrasonography,US)、肝臟增強計算機斷層成像(computed tomography，CT)、肝臟增強磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)等。慢性乙型肝炎組及肝硬化組的診斷依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2015版)》。其他臟器惡性腫瘤組的入選標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)各腫瘤臨床診斷指南或標(biāo)準(zhǔn)。健康對照組選取體檢中心80名排除已知的良性或惡性疾病、外表正常、無任何可見疾病癥狀的人。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①合并丙型肝炎病毒(hepatitis，HCV)、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、Epstein-Barr(EB)病毒及巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)感染、酒精性肝病、自身免疫性肝炎的患者的血清樣本；②樣本收集時間或病例信息不明確；③試驗操作中因失誤導(dǎo)致樣本量不足檢測的樣本。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、標(biāo)本采集及檢測

使用寡糖鏈檢測試劑盒,參照說明書，測定血清樣本中寡糖鏈的含量即指紋圖譜(G-Test 圖譜)，通過計算分析出寡糖組分的相對含量關(guān)系(G值)與肝癌的相關(guān)性：G≥5 時， 判定結(jié)果為陽性;G<5時， 判定結(jié)果為陰性。AFP的檢測使用Roche Cobas e602電化學(xué)發(fā)光分析儀(德國羅氏公司)，檢測血清樣本中AFP含量，參考值范圍：<20 ng/mL。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料以中位數(shù)(四分位間距)表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗；計數(shù)資料用百分比(%)表示，用卡方檢驗進行比較；用受試者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評價G值和AFP的診斷價值，建立聯(lián)合檢測G值和AFP的Logistic回歸模型；ROC曲線下面積(area under curve,AUC)的比較采用Z檢驗；P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。

結(jié) 果

一、納入人群的人口學(xué)特征

慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平明顯高于健康對照組及其他惡性腫瘤(P均<0.001)，血小板(platelets,PLT)水平明顯低于其他兩組 (P均<0.001)；而白蛋白(albumin,ALB)在肝癌組、其他腫瘤組及肝硬化患者中顯著下降(P<0.001)；肝硬化組的總膽紅素(total bilirubin,TBIL)水平明顯高于其他四組(P均<0.001)。血清甲胎蛋白水平≥2 0 ng/L及G≥5的陽性率均以肝癌最高(P<0.0 01)(表1)。

二、不同組別患者血清中寡糖鏈組分相對含量的比較

HCC組的G值[6.56(5.70～7.38)]顯著高于其他惡性腫瘤組[3.57(2.76～4.16)]、肝硬化組[3.38(2.87～4.35)]、肝炎組[3.30(2.57～3.99)]及正常健康組[2.82(2.28～3.65)](P均<0.001)。此外，肝硬化組與正常健康組的G值差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

表1 研究人群的臨床基線資料

表2 G-Test、血清AFP水平、及聯(lián)合檢測鑒別診斷HBV相關(guān)性HCC與良性肝病的診斷價值

①表示G值與AFP 200 ng/mL相比，P<0.001；②表示G值與AFP 400 ng/mL相比，P<0.001；③表示G值與AFP 20 ng/mL相比，P<0.05

注：*為P<0.001

三、血清中寡糖鏈組分含量相對關(guān)系診斷肝癌的價值及其與甲胎蛋白的相關(guān)性比較

將CHB組與LC組合并為良性肝病組(benign liver diseases,BLD)，分析得出BLD組與HCC組血清寡糖鏈組分含量相對關(guān)系(G值)與甲胎蛋白呈正相關(guān)(斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)0.327，P<0.001)。采用Logistic回歸分析建立聯(lián)合診斷模型，模型的預(yù)測概率保存在Logistic回歸分析中，并作為新的變量進入ROC曲線分析；構(gòu)建出G值、AFP單獨檢測及兩者聯(lián)合檢測在鑒別診斷良性肝病與HBV相關(guān)性HCC的ROC曲線 (圖2)。血清中寡糖鏈組分含量的相對關(guān)系單獨檢測在鑒別HBV相關(guān)性肝癌和慢性乙型肝炎的AUC值(0.882，95%CI0.839～0.917 )高于甲胎蛋白單獨檢測(0.801，95%CI0.750 ～ 0.846，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。聯(lián)合檢測與甲胎蛋白單獨檢測相比，AUC值顯著升高(0.928[95%CI0.891～0.845] VS 0.801[95%CI0.750～0.846]；P<0.001)。

四、診斷指標(biāo)評估

評估指標(biāo)包括敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比、陰性似然比、準(zhǔn)確率與Kappa值(表2)。與AFP單獨檢測常用界值20、200、400 ng/mL相比，G值的診斷敏感性分別從75.00%、52.50%、42.50%提高到85.83%，并且其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。準(zhǔn)確率分別從71.93%、73.33%和75.09%提高到85.61%(其中，85.61%與71.93相比，P<0.05)。聯(lián)合診斷的Kappa值為0.767，G值的Kappa值0.707。

圖2 G值、AFP以及基于Logistic回歸分析的聯(lián)檢測模型受試者操作特征(ROC)曲線在鑒別HBV相關(guān)性肝癌組和良性肝病組(慢性乙型肝炎組+乙型肝炎肝硬化組)中的診斷價值。

五、通過ROC曲線分析G-Test在鑒別不同組別人群的診斷價值

G-Test在鑒別診斷乙型肝炎病毒相關(guān)性HCC組與非HCC組的AUC值為0.886 (95%CI0.847～0.925)，在鑒別肝癌組與正常健康組、肝癌組與慢性乙型肝炎組、肝癌組與乙型肝炎肝硬化組及肝癌組與其惡性腫瘤組的AUC值分別是0.938(95%CI0.896～0.968)、0.897(95%CI0.849～0.933)、0.857(95%CI0.798～0.905)及0.834(95%CI0.771～0.896)。

六、G-Test及不同界值的AFP對不同分期HCC患者的檢測靈敏度的比較

根據(jù)中國肝癌的分期方案(China liver cancer staging,CNLC)對肝癌組患者進一步分層[3-4]，其中早期(Ⅰ-Ⅱa期)患者有90例，中晚期(Ⅱb-Ⅳ期)患者有30例。在早期患者的診斷中，G-Test的靈敏度與AFP界值為20 ng/mL相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；此外，G-test的靈敏度顯著高于AFP界值200 ng/mL及400 ng/mL(P<0.001)(如表3)。在晚期肝癌的診斷中，G-Test與AFP值常用的界值檢測靈敏度無明顯差異(P=0.111)。

七、G-Test在AFP陰性肝癌患者的檢測敏感度

分別以常用AFP水平20、200、400 ng/mL為界值，AFP陰性患者分別有30例、57例及69例，G-Test在AFP陰性患者中的檢測靈敏度分別為90.00%、87.72%、86.96%。

討 論

對慢性HBV感染者定期監(jiān)測，有利于盡早發(fā)現(xiàn)肝癌，然而迄今為止尚無通過血液快速準(zhǔn)確診斷肝癌的檢測技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，多種癌癥與異常的糖基化相關(guān)，臨床上一些常用于癌癥診斷、監(jiān)測及評估預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物即為糖蛋白[4-7]。

圖3 G-Test在鑒別不同組時的ROC曲線

表3 G-Test及AFP對不同分期的肝癌檢測敏感度

在本研究中，使用熒光毛細(xì)管電泳法測定五組不同人群血清中寡糖鏈相對含量并繪制圖譜，繼而計算分析出血清中寡糖鏈組分的相對含量關(guān)系，即G值；當(dāng)G≥5時結(jié)果為陽性。檢測僅需2μL血清，進行微觀分子結(jié)構(gòu)層面的、高通量的血液糖蛋白寡糖鏈指紋圖譜分析，快速得出診斷結(jié)果。筆者發(fā)現(xiàn)肝癌組G值陽性率顯著高于其他四組。此外，肝硬化組與正常健康組的G值也存在顯著差異，可能是與肝硬化患者血清中異常的糖基化相關(guān)[2, 8]。 既往已有研究證實肝癌及其他肝病患者體內(nèi)存在寡糖鏈組分及含量的變化，并且依據(jù)寡糖鏈圖譜建立了診斷模型(如Glyco Cirrho Test及Glyco HCC Test等)，具有良好的診斷效能[9-13]。

目前，臨床上應(yīng)用的傳統(tǒng)肝癌血清學(xué)標(biāo)志物主要是AFP，然而其敏感性較低，限制了其臨床實用性。值得關(guān)注的是，本研究中，G-Test的靈敏度從400ng/ml的AFP臨界值的42.50%顯著提高到85.83%，并且與AFP臨界值20、200ng/ml相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。說明G-Test在提高肝癌診斷的靈敏度方面具有一定的優(yōu)勢，但仍需要進一步地擴大樣本量來驗證。血清中AFP在鑒別診斷肝癌與慢性肝病患者(CHB及LC組患者)的ROC曲線下面積為0.801。為進一步評價G-Test及其與甲胎蛋白的聯(lián)合診斷價值，采用Logistic回歸分析建立聯(lián)合檢測模型。以上結(jié)果表明，G-Test的AUC顯著高于AFP(P<0.05)，而聯(lián)合檢測也顯著提高了AUC(P<0.001)。這提示G值可作為肝癌無創(chuàng)性診斷指標(biāo)，與AFP聯(lián)合診斷時，診斷效能更佳。此外，與AFP單獨檢測(20、200、400 ng/mL)相比，聯(lián)合檢測的Kappa值分別由0.437、0.463、0.412提高到0.767。說明聯(lián)合診斷與臨床診斷有較好的一致性。

我國AFP陰性的HCC患者高達30%～40%[3]，與本研究基本一致，本研究中AFP陰性的HCC患者約占25.00%。G-Test對AFP陰性的HCC患者有較好的靈敏度。提示G-Test可能成為AFP陰性HCC患者的有效血清學(xué)檢測方法。將肝癌組按CNLC標(biāo)準(zhǔn)分期后，進一步發(fā)現(xiàn)G-Test對早期患者的檢測靈敏度顯著高于AFP，表明G-Test可提高早期肝癌的診斷率。

在針對不同組別患者的診斷時，血清中寡糖鏈組分的相對含量值也表現(xiàn)較高的診斷效能，這與相關(guān)報道研究結(jié)果一致[9, 13]。且在本組數(shù)據(jù)中，G-Test與AFP呈正相關(guān)，在肝癌診斷方面可相互補充，提高HCC的診斷率。

本研究尚且存在一些局限性：一是樣本量比較小，所得結(jié)論有待于繼續(xù)擴大樣本量進行驗證；二是G-Test能否進一步提高早期肝癌的診斷率，肝癌患者血清中寡糖鏈組分的相對含量水平變化與肝癌患者預(yù)后其復(fù)發(fā)風(fēng)險之間是否存在關(guān)聯(lián)等問題，需要進一步研究闡明。