屈鳳祥， 常 紅， 林 毅， 王 芳， 王加蘭

青島大學附屬醫(yī)院兒科，青島 266000

過敏性紫癜(Henoch-Sch?nlein purpura, HSP)是一種常發(fā)生于兒童的小血管炎，可導致各種臨床癥狀，如皮膚紫癜、關節(jié)炎和(或)關節(jié)痛、腹痛和腎臟受累表現(xiàn)。其中，20%～55%的過敏性紫癜患兒會發(fā)生腎臟損害[1]，部分腎損害可進展為腎功能不全，導致患兒不良遠期預后。目前，HSP的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，但其病因和發(fā)病機制仍不清楚。

細胞因子參與維持人體免疫系統(tǒng)促炎和抗炎功能的動態(tài)平衡[2]。首先促炎因子促進自身免疫性炎癥的啟動和擴散，隨后抗炎因子促進炎癥消退和急性期恢復，并誘導自身抗體聚集[3]。白細胞介素-1(IL-1)是一種典型的促炎細胞因子，其中IL-Iβ是內皮細胞以自分泌方式表達IL-1的重要刺激因子。T細胞中的IL-1β可誘導顯著而持久的一級和二級CD4反應[4]。

HSP具有家族聚集性，即遺傳因素可能在其發(fā)病過程中起重要作用[5]。B淋巴細胞多克隆活化為HSP特征，而IL-1β參與刺激B細胞增殖和分化，由此推測IL-1β功能異常可能參與HSP的發(fā)生。rs1143627可能影響IL-1β轉錄因子轉錄調節(jié)區(qū)功能，通過降低細胞因子IL-1Ra的拮抗特性而影響IL-1β水平[6]。因此，本研究對IL-1β基因rs1143627位點的單核苷酸多態(tài)性與HSP及紫癜性腎炎(Henoch-Sch?nlein purpura nephritis, HSPN)的相關性進行探討，以期為HSPN的個性化治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年1月至2019年12月青島大學附屬醫(yī)院兒科收治的174例HSP患兒作為病例組。所有患兒均符合2006年EULAR/PReS制定的兒童血管炎分類標準，至少隨訪6個月。所有參與者均通過臨床和實驗室檢查篩查，排除免疫性血小板減少性紫癜、風濕性關節(jié)炎、敗血癥、其他腎臟疾病和外科急腹癥等疾病。本研究方案由青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，并取得家屬知情同意。

1.2 診斷標準 HSP診斷參考EULAR/PReS 2006年制定的兒童血管炎分類標準[7]，即可觸性(必要條件)皮疹伴以下任意1條：(1)彌漫性腹痛；(2)任何部位活檢示IgA沉積；(3)關節(jié)炎或關節(jié)痛；(4)腎臟受損表現(xiàn)[血尿和(或)蛋白尿]。HSPN的診斷及腎臟病理分級參考中華醫(yī)學會兒科學分會腎臟病學組2009年制定的診治循證指南[8]：在HSP 6個月病程內，出現(xiàn)血尿和(或)蛋白尿。

1.3 分 組 根據臨床癥狀將病例組分為單純型組(僅表現(xiàn)為皮膚紫癜)、關節(jié)型組(皮膚紫癜合并關節(jié)癥狀)、腹型組(皮膚紫癜合并消化道癥狀)、混合型組(皮膚紫癜合并關節(jié)癥狀，同時伴有消化道癥狀)；根據隨訪過程中是否發(fā)生HSPN分為非HSPN組、HSPN組。另選擇162名于我院體檢的年齡匹配的健康兒童作為對照組。

1.4 IL-1β基因rs1143627位點檢測及測序

1.4.1 標本收集及DNA提取 清晨抽取患者空腹外周靜脈血2 mL，置于EDTA抗凝管中，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用天根生化科?北京)有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.4.2 引物設計與合成 應用Primer 3軟件針對目的基因全長進行特異性多重引物設計(表1)。引物合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 rs1143627引物序列表

1.4.3 多重PCR擴增目的基因及測序 PCR反應擴增條件：94 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃延伸5 min，共30個循環(huán)。將PCR產物進行電泳檢測，采用3%瓊脂糖凝膠，PCR產物上樣5 μL(圖1)，根據多重PCR重數確定稀釋小試樣本數，進行qPCR檢測(圖2)。通過雙端barcode原理區(qū)分不同樣本并混樣建庫后，在Illumina X-10平臺測序。

呼吸困難是急性期中重度COPD患者常見的臨床癥狀，是患者病情復發(fā)住院的主要誘發(fā)因素之一[5]。而肺康復治療的主要觀察指標是患者的呼吸困難癥狀是否獲得有效改善[6]。通過呼吸及功能鍛煉能較快經鼻深吸氣，且能讓肋間外肌、膈肌等吸氣肌參與到整個吸氣過程中，使進入肺中的氣量盡可能多，能有效防止氣道過早的陷閉，吸氣后再緩慢地縮唇呼氣，延長呼氣時間，以減少呼氣末期肺內潴留的二氧化碳含量，利于氣體交換，從而有效改善患者呼吸困難癥狀[7]。

圖1 部分DNA樣品PCR電泳結果

圖2 qPCR結果

2 結 果

2.1 HSP患兒臨床病理特點 174例HSP患兒中，單純型40例、關節(jié)型77例、腹型24例、混合型33例，均在門診接受了至少6個月的隨訪，平均隨訪(9.1±2.7)個月。隨訪結果顯示104例HSP患兒完全緩解(尿檢無異常，非HSPN組)，70例患兒表現(xiàn)為持續(xù)腎臟損傷(HSPN組)。HSPN組70例患兒中孤立性血尿28例(40.0%)、孤立性蛋白尿22例(31.4%)、血尿合并蛋白尿20例(28.6%)。HSPN組70例患兒中12例行腎臟穿刺活檢，病理分級：Ⅰ級2例，Ⅱa級2例，Ⅲa級3例，Ⅲb級3例，Ⅳa級1例，Ⅳb級1例。病例組與對照組、非HSPN組與HSPN組間研究對象年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 病例組與對照組研究對象年齡性別比較

2.2 病例組與對照組rs1143627基因型和等位基因頻率的比較 rs1143627基因型頻率與等位基因在病例組與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。等位基因G(OR=0.671，95%CI 0.494～0.911)可能是HSP發(fā)病的危險因素

表3 病例組與對照組中rs1143627基因型和等位基因比較 n(%)

2.3 病例組中各臨床癥狀亞組rs1143627基因型和等位基因頻率比較 rs1143627基因型頻率與等位基因在HSP不同臨床癥狀分組間差異無統(tǒng)計學意義(表4)。

2.4 病例組中非HSPN組與HSPN組基因型和等位基因頻率的比較 rs1143627基因型與等位基因在非HSPN組與HSPN組中差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表5)。等位基因G(OR=1.731,95%CI 1.123～2.669)可能是HSPN發(fā)病的危險因素。

2.5 Hardy-Weinberg平衡定律檢測 Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示：rs1143627基因座的基因型與HSPN表型具有相關性(χ2=0.028，P=0.866)，表明該位點具有HSPN群體代表性。

3 討 論

HSP是兒童最常見的系統(tǒng)性血管炎，在4～6歲兒童中發(fā)生率最高[9]。HSP患兒多可自行緩解，預后佳。然而，部分患兒可累及腎臟，并發(fā)展為慢性腎臟病。目前HSP的病因與發(fā)生機制尚不明確。在HSP急性期，血清IgA濃度升高，IL-2、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α (TNF-α)異常表達[5,10]，提示該病為免疫介導性疾病?；虍惓绊懠毎蜃拥谋磉_，單核苷酸多態(tài)性改變可能影響對應細胞因子的功能。

表4 病例組各臨床癥狀亞組中rs1143627基因型和等位基因比較 n(%)

表5 非HSPN組與HSPN組中rs1143627位點基因型和等位基因比較 n(%)

系統(tǒng)性血管炎性疾病(如HSP)患者各器官組織的慢性炎癥反應常由TNF-α、IL-6和IL-1β等多種細胞因子異常高表達引發(fā)。類風濕性關節(jié)炎(RA)、2型糖尿病、川崎病等炎癥性疾病[12-15]的易感性與IL-1β基因多態(tài)性的關系得到了證明。此外，一項研究在IL-1β缺陷小鼠模型(IL-1β-/-和IL-1α/β-/-)中發(fā)現(xiàn)，IL-1β介導的免疫刺激和炎癥反應在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中發(fā)揮作用[16]。本研究結果顯示，與對照組相比，病例組IL-1β rs1143627位點GG基因型頻率增加(P=0.016)，且等位基因G頻率增加(P=0.010)，故推測等位基因G可能是HSP易感的危險因素。

成熟的IL-1β基因能刺激環(huán)氧合酶2和誘導型一氧化氮合酶基因(NOS2A)等(炎癥和免疫相關基因的表達)[11]。NOS2A能誘導內皮細胞活化，進而釋放一氧化氮(NO)和大量細胞因子，影響白細胞游走、遷移以及黏附，并能影響?zhàn)じ揭蜃拥幕钚裕罱K損傷血管壁、腎臟等組織。Martin等[17]發(fā)現(xiàn)，HSP患者和對照組NOS2A啟動子等位基因和基因型頻率差異明顯，表明該基因在HSP易感性和腎炎發(fā)展中具有潛在作用。本研究顯示，非HSPN組rs1143627位點GG基因型頻率高于HSPN組(P=0.024)，且兩組等位基因G差異有統(tǒng)計學意義(P=0.013)，進一步說明rs1143627位點基因型GG與等位基因G可能是HSP的易感基因，且與HSPN的發(fā)生有關。

另外，一項檢測炎癥對脂質代謝影響的研究[18]發(fā)現(xiàn)，IL-1β可導致腎小球系膜細胞中膽固醇酯積累，從而導致活性氧產生和內質網應激?；钚匝醮x產物可引起多種病理破壞，包括系統(tǒng)性血管炎和腎臟疾病。HSP患者氧化應激水平升高，脂質過氧化可能在HSP發(fā)病和腎損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[19]。

本研究中，rs1143627位點基因型和等位基因在病例組臨床癥狀分型中差異無統(tǒng)計學意義。該結果可能與各分型樣本量較少有關，后期會通過加大樣本量繼續(xù)證實。同時，尚需在多中心、多地區(qū)、多民族人群中驗證本研究結果。

綜上所述，IL-1β作為參與免疫反應的重要因子，其基因多態(tài)性與HSP及腎損害密切相關，其rs1143627位點等位基因G可能是兒童HSP及腎臟損傷的危險因素。該位點基因多態(tài)性可能通過影響基因調控導致患者血清細胞因子水平改變而致病。建立基因型與其表型之間的功能相關性模型是決定基因多態(tài)性臨床意義的關鍵，并能為患兒的個體化治療提供依據。