尹燦昆， 賽音賀西格， 郭欣欣， 高 峰， 侯英勇， 紀(jì) 元*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前全球范圍內(nèi)致死率排第4位的惡性腫瘤，患者預(yù)后受到流行病學(xué)分布、腫瘤組織病理分級(jí)和基因表達(dá)改變等多層次因素的共同影響。腫瘤微脈管侵犯(microvascular invasion，MVI)是指顯微鏡下可見(jiàn)微血管腔內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的癌細(xì)胞巢團(tuán)。MVI是降低患者生存預(yù)期重要的預(yù)后因素[1-4]。

在癌栓播散、轉(zhuǎn)移過(guò)程中，機(jī)體會(huì)釋放T、B淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞協(xié)同抑制HCC生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤浸潤(rùn)。但以PD-1為代表的免疫抑制性產(chǎn)物可抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫能力，增加術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。PD-1表達(dá)不局限于T細(xì)胞，還表達(dá)于B細(xì)胞、NK細(xì)胞以及一些腫瘤細(xì)胞。PD-1+T細(xì)胞常見(jiàn)于健康人體的循環(huán)系統(tǒng)，參與維持免疫穩(wěn)態(tài)，阻止自身免疫和過(guò)度的免疫反應(yīng)。然而，病理狀態(tài)下這種功能可被腫瘤細(xì)胞利用以進(jìn)行免疫逃逸。因此PD-1是新型的腫瘤防治靶標(biāo)[5-6]。近年來(lái)基于PD-1、PD-L1的免疫微環(huán)境靶向藥物研發(fā)及臨床應(yīng)用在HCC防治領(lǐng)域取得了顯著成效。

既往研究大多集中于MVI腫瘤細(xì)胞對(duì)HCC患者預(yù)后的影響，鮮有針對(duì)其所在局部免疫微環(huán)境對(duì)HCC患者預(yù)后影響的研究。針對(duì)MVI本身和免疫微環(huán)境的研究，或許可確定其是否可成為HCC獨(dú)立預(yù)后因素，并可進(jìn)一步豐富其在HCC中的價(jià)值。因此，本研究使用HBV相關(guān)HCC病理數(shù)字切片，并量化數(shù)字切片中MVI免疫微環(huán)境中T、B淋巴細(xì)胞數(shù)及PD-1抗體表達(dá)，將量化數(shù)據(jù)引入預(yù)后分析，結(jié)合部分基本臨床指標(biāo)，初步探討潛在的免疫病理學(xué)指標(biāo)對(duì)HBV相關(guān)HCC預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為回顧性隊(duì)列研究，樣本來(lái)自2012年3月至2013年11月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院初診的HCC患者。患者HCC組織學(xué)分化中且術(shù)前均無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。收集性別、年齡、肝纖維化程度、腫瘤最大徑，巴塞羅那分期(Barcelona clinic liver cancer，BCLC)分期和甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)水平等指標(biāo)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有入選病例均有HBV感染史且無(wú)其他肝臟疾病基礎(chǔ)；術(shù)后未經(jīng)介入、放化療、射頻等其他治療方案；組織學(xué)分化中等且術(shù)前無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：隨訪結(jié)束后剔除非HCC致死和術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)時(shí)間不足2周的患者。納入病例均定期隨訪，終點(diǎn)事件為復(fù)發(fā)或死亡。末次隨訪為2018年11月30日。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 HCC標(biāo)本MVI的鑒別及癌栓局部微環(huán)境免疫狀態(tài)的觀察 調(diào)取入選患者術(shù)后病灶組織蠟塊，并復(fù)對(duì)已有H-E切片確定病灶有無(wú)MVI浸潤(rùn)。對(duì)腫瘤保留完好的蠟塊按4 μm連續(xù)切片，行免疫組化染色，觀察CD3(LN10，Lecia)、CD4(4B12，Lecia)、CD8(Poly，Abcam)、CD20(L26，Dako)、PD-1(EPR4877，Abcam)表達(dá)水平。采用Aperio AT2400通量明場(chǎng)掃描儀(Lecia)掃描H-E和免疫組化玻片(最大放大倍數(shù)為200倍)，依據(jù)數(shù)字切片成片質(zhì)量，篩選出可用于免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)的標(biāo)本。

1.3 切片質(zhì)量分析及細(xì)胞表達(dá)量化 采用ImageJ定位數(shù)字切片中MVI，計(jì)數(shù)MVI中完整癌栓切面(in)及脈管外熱點(diǎn)處(ex)相同范圍的免疫細(xì)胞；對(duì)多個(gè)癌栓者，選最多3處肉眼可見(jiàn)的部位。計(jì)數(shù)后取平均值，計(jì)算CD4、CD8、PD-1、CD20表達(dá)量與CD3的比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對(duì)MVI在內(nèi)的各類臨床資料進(jìn)行Fisher檢驗(yàn)。將多組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的數(shù)據(jù)納入多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型，并進(jìn)行似然比檢驗(yàn)。剔除免疫細(xì)胞表達(dá)數(shù)據(jù)的極大及極小值后，使用受試者工作特征曲線(ROC)與約登指數(shù)篩選MVI樣本中具有潛在分析價(jià)值的免疫細(xì)胞標(biāo)志物，并確定這些標(biāo)志物在癌栓或其周?chē)谓M織的表達(dá)截?cái)嘀?，按閾值進(jìn)行分組。采用多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析不同免疫細(xì)胞或其標(biāo)志物表達(dá)情況對(duì)HCC患者預(yù)后影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 MVI與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性 納入175例HCC患者，死亡35例，復(fù)發(fā)88例。單因素分析結(jié)果(表1)表明：死亡患者與存活患者年齡和MVI發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明年齡≤50歲和有MVI是患者死亡的預(yù)測(cè)因素。復(fù)發(fā)患者與無(wú)復(fù)發(fā)患者腫瘤最大徑和MVI發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明HCC為塊狀型和有MVI均為HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的重要預(yù)測(cè)因素。

表1 HBV相關(guān)HCC患者預(yù)后單因素分析 n

多因素分析結(jié)果(表2)及生存分析(圖1)表明：年齡和MVI不是患者死亡的獨(dú)立影響因素；腫瘤最大徑和MVI是患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。

表2 影響患者預(yù)后的多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型

圖1 患者術(shù)后OS與RFS的Kaplan-Meier生存曲線

2.2 癌栓局部免疫細(xì)胞數(shù)量對(duì)患者預(yù)后判斷截?cái)嘀档慕缍?/p>

2.2.1 陽(yáng)性免疫細(xì)胞判斷 通過(guò)樣本質(zhì)控、復(fù)核和細(xì)胞計(jì)數(shù)，成功篩選出53例伴MVI患者(截至末次隨訪，15例死亡、31例復(fù)發(fā))的HCC樣本，對(duì)其腫瘤指標(biāo)進(jìn)行H-E染色及局部免疫細(xì)胞染色(圖2)。

圖2 伴MVI的HCC患者癌栓局部組織CD4和CD8的表達(dá)Original magnification: ×200

2.2.2 免疫細(xì)胞判斷預(yù)后的界值 結(jié)果(表3、圖3)表明：CD4+在MVI周?chē)伪磉_(dá)密度(CD4ex)改變對(duì)HCC患者術(shù)后OS有潛在預(yù)測(cè)價(jià)值(P=0.086)，最佳截?cái)嘀禐?.330；CD4+和CD8+細(xì)胞在瘤栓內(nèi)表達(dá)密度(CD4in和CD8in)對(duì)HCC患者術(shù)后RFS有預(yù)測(cè)價(jià)值(P<0.05)，而CD8+在MVI周?chē)闻K的表達(dá)密度(CD8ex)對(duì)RFS有潛在預(yù)測(cè)價(jià)值(P=0.051)，最佳截?cái)嘀捣謩e為0.208、0.465、0.655。

2.3 MVI癌栓局部不同CD4和CD8表達(dá)量對(duì)患者預(yù)后的影響 結(jié)果(表4)顯示：不同CD4ex表達(dá)組患者術(shù)后OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)，不同CD4in、CD8in和CD8ex表達(dá)組間RFS差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 伴MVI的HCC患者癌栓局部免疫細(xì)胞ROC分析結(jié)果

圖3 MVI癌栓局部?jī)?nèi)外CD4+、CD8+ T細(xì)胞對(duì)HCC患者術(shù)后OS及RFS影響的ROC曲線

表4 MVI免疫微環(huán)境中CD4和CD8細(xì)胞數(shù)量對(duì)患者預(yù)后影響

3 討 論

MVI是影響HCC預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素。Meniconi等[7]、Hirokawa等[8]研究表明，HCC首次術(shù)后對(duì)其組織病理切片中的MVI進(jìn)行評(píng)估，對(duì)HCC復(fù)發(fā)和整體預(yù)后評(píng)判具有重要臨床意義，而探索MVI腫瘤組織及其微環(huán)境，特別是癌栓中及周?chē)庖呒?xì)胞表達(dá)，或有助于患者個(gè)體化治療方案的選擇。

本研究中相關(guān)因素分析結(jié)果表明，MVI可作為HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，也可用于免疫微環(huán)境位點(diǎn)量化研究和患者生存分析。目前相關(guān)研究集中于HCC原發(fā)灶的免疫微環(huán)境表達(dá)譜，所需考慮的因素繁雜，而MVI的形態(tài)學(xué)診斷位點(diǎn)還有待深入研究。HCC原發(fā)灶T、B等免疫細(xì)胞數(shù)量增多是預(yù)后的積極因素。Kurebayashi等[9]通過(guò)對(duì)HCC腫瘤微環(huán)境中B/漿細(xì)胞、T細(xì)胞計(jì)數(shù)制定免疫分型標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞高度浸潤(rùn)的HCC患者的預(yù)后更好；而且分化較差的HCC (CK19+和SALL4+)中若T、B細(xì)胞高度浸潤(rùn)，則患者預(yù)后也較好。Lim等[10]發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)HCC比非病毒相關(guān)HCC表達(dá)更多的PD-1，更易造成T細(xì)胞免疫耗竭。本研究發(fā)現(xiàn)，MVI癌栓內(nèi)以CD4+和CD8+T細(xì)胞為代表的獲得性免疫細(xì)胞數(shù)量與患者術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。Gabrielson等[11]與Garnelo等[12]得出相似結(jié)果?？傊?，量化分析HCC腫瘤原發(fā)灶免疫微環(huán)境、結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，給予合并MVI的HCC患者M(jìn)VI免疫病理診斷及個(gè)體化免疫治療，或可進(jìn)一步減少HCC術(shù)后復(fù)發(fā)率，延長(zhǎng)患者的生存期。

此外，本研究中PD-1表達(dá)量會(huì)隨T細(xì)胞增多而增加，但MVI瘤栓和周?chē)闻K的PD-1均無(wú)預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值。由于PD-1并非唯一引發(fā)腫瘤免疫耐受的因素，且其功能多樣[13-15]，故針對(duì)以PD-1為代表的多種腫瘤免疫抑制因子的多因素研究將是下一步MVI免疫微環(huán)境量化分析的側(cè)重點(diǎn)。此外，因本研究中PD-L1表達(dá)水平很低，無(wú)法獲取癌栓中的PD-L1表達(dá)量化數(shù)據(jù)，故未來(lái)可能更換新的腫瘤免疫抑制標(biāo)志物。利用ImageJ對(duì)數(shù)字切片進(jìn)行整體觀察、多點(diǎn)定位和細(xì)微觀測(cè)，是一種高效便捷的方案。本研究表明，HBV相關(guān)HCC原發(fā)灶CD4+/CD8+T細(xì)胞增多可抑制HCC復(fù)發(fā)、延長(zhǎng)RFS，并證明上述方案在HBV相關(guān)HCC研究中可行。將來(lái)會(huì)納入更多的HCC患者，同時(shí)探索可用于免疫病理學(xué)診斷的更多數(shù)據(jù)，以期為融合免疫微環(huán)境指標(biāo)的HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，HBV相關(guān)HCC微脈管癌栓內(nèi)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)量增加可能與患者首次術(shù)后復(fù)發(fā)率降低、RFS延長(zhǎng)有關(guān)。