劉文雯，馬 昕，王美娟，寧慧娟，鐘雪梅

首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 100020

近年來，隨著分子醫(yī)學及遺傳代謝相關的檢測技術的發(fā)展，嬰兒膽汁淤積癥的疾病譜正在發(fā)生轉(zhuǎn)變，各種基因突變引起的遺傳代謝性嬰兒膽汁淤積癥逐漸被認識。希特林蛋白缺陷病(citrin deficiency，CD)為一種常染色體隱性遺傳疾病，最初在日本首次報道[1]，在亞洲國家多見。目前認為有3種臨床類型：(1)Citrin蛋白缺陷所致的新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥(neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency，NICCD)；(2)Citrin蛋白缺陷病導致的發(fā)育不良和血脂異常(failure to thrive and dyslipidemia caused by citrin deficiency，F(xiàn)TTDCD)[2]，是一種中間表型；(3)成人中作為復發(fā)性高氨血癥伴神經(jīng)精神癥狀的瓜氨酸血癥Ⅱ型(adult-onset type citrullinemia Ⅱ, CTLN 2)。NICCD是常見的引起嬰兒膽汁淤積的病因，占我國遺傳代謝病第2位[3]，僅次于甲基丙二酸尿癥，是我國嬰兒膽汁淤積性肝病重要病因。SLC25A13基因突變類型分布有明顯的地域差異，北方群體的SLC25A13等位基因異質(zhì)性明顯高于南方群體，既往關于我國NICCD的病例及相關基因報道多來自于南方地區(qū)，本文主要分析北方地區(qū)NICCD患兒的病例特點及基因突變情況。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2015年1月—2018年12月于首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院消化內(nèi)科住院，并經(jīng)血串聯(lián)質(zhì)譜、尿氣相色譜和/或基因檢測確診的23例NICCD患兒的臨床資料(NICCD組)。NICCD診斷標準[4]：(1)具有膽汁淤積的臨床表現(xiàn)；(2)血串聯(lián)質(zhì)譜和尿氣相色譜診斷；(3)基因檢測示SLC25A13突變。以上3條需符合2條方可診斷，或僅有(3)同時為純合或復合雜合致病性突變。同時收集與NICCD組同期的特發(fā)性肝內(nèi)膽汁淤積癥(idiopathic intrahepatic cholestasis, INC)患兒36例為INC組，即完善生化、病原、腹部影像學、血尿遺傳代謝篩查、代謝性肝病相關基因panel檢測等仍不能明確膽汁淤積病因的患兒。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料 收集患兒臨床資料，包括住院時年齡、性別、尿色、大便顏色改變情況、肝脾大程度、發(fā)病時間、出生史。

1.2.2 實驗室檢查 收集患兒未經(jīng)系統(tǒng)治療前的血常規(guī)、生化、凝血、血氣分析、血氨、甲胎蛋白、病原學檢查、甲狀腺功能檢測(對于多次檢測的項目取最高值)、血串聯(lián)質(zhì)譜(MS-MS)分析以及尿氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)。

1.2.3 病理檢查 部分病例全麻下行腹腔鏡探查+膽道造影+肝活檢術，術中取肝組織HE染色后光鏡觀察。由本院病理科完成病理切片制作，由資深病理老師閱片并出具病理報告。

1.2.4 高通量基因測序檢測 住院期間留取患兒及父母外周血標本2～3 ml，置于EDTA抗凝管保存。由北京邁基諾醫(yī)學檢驗所對膽汁淤積癥相關的目標基因位點進行高通量捕獲測序檢測分析。

1.3 倫理學審查 本研究通過首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，批號：SHERLL2020014?；純罕O(jiān)護人已充分知情并簽署書面知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 23例NICCD患兒中，籍貫均為長江以北，主要來自北京市、河北省、山東省、山西省；男女比例為16∶7，均為足月兒，但出生體質(zhì)量偏低，平均體質(zhì)量為(2912.00±486.55)g。伴有肝外畸形者5例(21.7%)，包括房間隔缺損2例，馬蹄腎、腎盂腎盞擴張、隱性脊柱裂各1例。36例INC患兒中，男女比例為26∶10，其中<35周的早產(chǎn)兒占4例，平均體質(zhì)量為(2878.00±523.49)g，肝外畸形4例，分別為房間隔缺損、小腸閉鎖、十二指腸發(fā)育不良、左室假腱索各1例。臨床表現(xiàn)比較詳見表1。

表1 NICCD組與INC組臨床表現(xiàn)比較

2.2 實驗室指標比較 23例NICCD患兒中，伴有低血糖患兒10例，伴有低白蛋白血癥患兒13例，伴有高血氨患兒17例，伴有高乳酸患兒15例；血脂指標中，15例LDL升高，6例TC升高，7例TG升高；凝血功能方面，17例PT延長，16例患兒活化部分凝血活酶時間(APTT)延長。與INC組對比，NICCD組GGT、TBA、APTT明顯高于INC組，Alb較INC組為低，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 NICCD組與INC組實驗室檢查結(jié)果對比

2.3 病理學檢查 3例NICCD患兒完善肝組織活檢，2例表現(xiàn)為肝細胞及毛細膽管淤膽，不同程度的炎性細胞浸潤，肝細胞脂肪變性、氣球樣變，可見點灶樣壞死、融合灶樣壞死；匯管區(qū)輕度擴大；其中1例肝小葉結(jié)構紊亂，可見假小葉形成，散可見吞噬色素顆粒的Kupffer細胞，病變相當于G3S4。1例主要表現(xiàn)為匯管區(qū)小膽管數(shù)量稀小，管腔狹小。

2.4 血MS-MS和尿GC-MS檢測 23例NICCD患兒中，共21例完成血MS-MS檢測，主要表現(xiàn)為蛋氨酸、瓜

氨酸、精氨酸和游離酰基肉堿(CO)及長鏈?；鈮A(C14、C16、C18∶1、C18∶2)的升高，通過血MS-MS檢測診斷NICCD 10例，占47.6%(10/21)。18例完善了尿GC-MS檢測，主要表現(xiàn)為半乳糖、半乳糖酸、半乳糖醇、4-羥基苯乳酸排泄增加。

2.5 基因檢測分析 在23例患兒中復合雜合突變9例，純合突變7例，7例為雜合突變(表3)。共檢測到16種突變類型，其中IVS14-9A>G、c1640 G>A、c.762T>A、c.736delG、c.1098 T del、c.851G>A、c.550G>A為新發(fā)現(xiàn)突變。其中10例進行了父母驗證，其中1例患兒父親為c.615+5G>A純合突變，余均為單個位點突變(表3)。病例6患兒為c.852_855del/IVS16ins3kb復合雜合突變，c.852_855del，導致氨基酸改變p.R284fs，為移碼突變，突變來源于母親，父親該位點無變異；IVS16ins3kb經(jīng)PCR擴增示先證者及父親發(fā)生突變，母親未發(fā)生突變(圖1、2)。病例7患兒為c.852_855del/c.615+5G>A復合雜合突變，c.852_855del(p.R284fs)突變來源于母親，父親該位點無變異；c.615+5G>A(splicing)為剪切突變，受檢人之父該位點純合變異，受檢人之母該位點無變異(圖3)。

注：1，陰性對照；2，陽性對照；3，患兒；4，患兒父親；5，患兒母親。

表3 23例NICCD患兒一般情況及SLC25A13基因突變檢測結(jié)果

注：a，先證者雜合突變；b，父親無變異；c，母親雜合突變。

注：a，先證者雜合突變；b，父親純合突變；c，母親無變異。

2.6 治療與轉(zhuǎn)歸 所有患兒入院后即予保肝利膽治療、對癥補充脂溶性維生素、調(diào)節(jié)腸道菌群、更換至無乳糖并強化中鏈脂肪酸奶粉喂養(yǎng)等，部分合并感染患兒使用抗生素治療，合并有巨細胞病毒感染者同時予以更昔洛韋抗病毒治療。2例患兒失訪，21例患兒經(jīng)過治療2～6個月后轉(zhuǎn)氨酶及膽紅素水平逐漸恢復正常，隨訪至1歲，患兒均無生長發(fā)育落后，其中2例患兒出現(xiàn)飲食偏好(喜食魚類、肉類，不喜主食)。1例患兒2歲8月齡并發(fā)膽總管結(jié)石合并急性胰腺炎。

3 討論

CD是由SLC25A13基因突變導致的一種常染色體隱性遺傳疾病，致病基因SLC25A13 位于染色體7q21.3上，編碼 Citrin 蛋白[1]。Citrin蛋白功能缺失時，NADH含量升高，NADH/NAD+比值升高，引起一系列代謝改變。同時，ATP產(chǎn)量減少，造成肝細胞能量缺乏[5]。

NICCD是我國嬰兒膽汁淤積性肝病重要病因。本研究中23例NICCD中，均為嬰兒期起病，其中新生兒期起病占56.5%，臨床表現(xiàn)為不同程度的皮膚黃染、深色尿、排黃色或淺黃色大便，有13%患兒有一過性白陶土樣大便，提示NICCD患兒亦可伴有嚴重的膽汁排泄障礙。其生化主要表現(xiàn)為膽紅素及酶學指標的異常，同時發(fā)現(xiàn)膽紅素及轉(zhuǎn)氨酶兩者的升高程度呈正線性相關，因線粒體功能障礙，蘋果酸轉(zhuǎn)運受阻，ATP產(chǎn)生減少，而膽小管膜上依賴ATP的載體蛋白轉(zhuǎn)運膽紅素發(fā)生障礙，造成嚴重膽汁淤積，從而加重肝細胞損害，造成惡性循環(huán)。轉(zhuǎn)氨酶指標中AST升高幅度較ALT顯著，因AST主要存在于肝細胞線粒體中，而ALT主要存在于細胞質(zhì)中，因Crtrin缺陷癥線粒體功能障礙，受損嚴重，故肝細胞膜被破壞后血AST升高較ALT更為明顯。同時伴有高乳酸、血氨輕度升高、低血糖、凝血功能異常、血脂異常，這與CD所引起的糖、脂肪、氨基酸代謝異常有關。NICCD組GGT、TBA、APTT明顯高于INC組，Alb較INC組低(P值均<0.05)，表明上述指標可起到鑒別NICCD的作用。

血MS-MS及尿GC-MS對于CD具有重要診斷意義。本研究中CD患兒的血MS-MS檢測主要表現(xiàn)為蛋氨酸、瓜氨酸、精氨酸不同程度的升高；除上述改變外，還有游離肉堿及長鏈?；鈮A代謝異常，此為肝功能異?；蚰懼俜e的非特異性改變，無明確指向性，本研究中，其陽性診斷率為47.6%(10/21)，較之前學者報道[6]的32.7%稍高。部分病例血、尿代謝篩查未見異常，提示其具有一過性，曾有研究報道[7-8]指出，血氨基酸異常只出現(xiàn)在疾病前2個月。其尿GC-MS檢測多表現(xiàn)為半乳糖、半乳糖醇、半乳糖酸、4-羥基苯乳酸的增高，與既往報道一致[9]。NICCD新生兒篩查敏感性較低可能與采血時間過早其代謝譜特征尚未明顯呈現(xiàn)有關，這為本病早期診斷增加了難度。

目前已報道SLC25A13基因變異100余種，最常見的突變類型為缺失突變、錯義突變、無義突變及剪接位點突變。我國報道了多種致病突變類型，包括大片段重復/缺失，Zhang等[10]通過單核苷酸多態(tài)性分析及半定量PCR技術發(fā)現(xiàn)了一個包含啟動子及外顯子1的21.7 kb缺失，完全抑制了其轉(zhuǎn)錄及翻譯，是目前發(fā)現(xiàn)的最長片段缺失。我國NICCD基因突變類型以c.851_854del(占58.41%)、c.1638_1660dup23(8.85%)、c.IVS6+5G>A(8.41%)和IVS16ins3kb(7.52%)最常見，該4種突變型在我國南方占比(87.9%)大于北方(63.6%)[11-12],并且北方群體的SLC25A13等位基因異質(zhì)性明顯高于南方群體[13]。

本研究23例CD患兒中，包括插入突變、缺失突變、剪切位點突變及錯義突變，其中高頻突變c.851_854del4占3例，c.852_855del4占5例，IVS16ins3kb占3例，c.1194A>G占5例；但未見c.1638_1660dup23的突變類型，考慮與標本量少及地域性有關。其中新發(fā)現(xiàn)突變7種，通過多種預測軟件均提示其合成的蛋白質(zhì)結(jié)構為不利蛋白。多種突變類型也證實了北方群體等位基因的高異質(zhì)性。本次研究中7例為單基因雜合突變，鑒于本次高通量基因測序檢測方式的局限性，是否存在大片段的插入/缺失突變或尚未發(fā)現(xiàn)的致病突變，還需進一步研究驗證。

本研究中病例5患兒合并膽總管結(jié)石伴急性胰腺炎。其6月齡診斷NICCD，基因突變類型為c.852_855TATCdel /c.550G>A的復合雜合突變，予對癥保肝利膽治療后約9月齡肝功能正常；2歲8個月出現(xiàn)急性腹痛癥狀，血生化示：血淀粉酶411 U/L，ALT 70.4 U/L, AST 49.2 U/L，膽紅素正常，甘油三酯 2.56 mmol/l，腹部影像學檢查提示膽總管結(jié)石征象伴胰腺腫脹，遂行ERCP下膽總管取石術以及胃鏡引導下鼻-空腸管放置術，術后予鼻飼泵奶15 d，并逐漸過渡至經(jīng)口喂養(yǎng)。隨訪患兒至今，目前5歲，生長發(fā)育正常，無特殊飲食偏好，肝功能正常?；純菏欠癜l(fā)展至FTTDCD還需進一步隨訪監(jiān)測。

病例6患兒的突變類型為第9外顯子c.852_855del和第16內(nèi)含子IVS16ins3kb的復合雜合突變，較為罕見，在國內(nèi)僅有6例報道[14]，本例患兒的蛋白質(zhì)結(jié)構和功能以及其對臨床預后的影響還需進一步研究，隨訪患兒目前1歲4個月，生長發(fā)育正常，無明顯飲食偏好，檢測肝功能正常。

NICCD治療主要為保肝利膽、脂溶性維生素補充以及無乳糖并含豐富的中鏈脂肪酸的特殊配方奶粉治療，飲食治療的效果已在許多病例報告中得到證實。NICCD一般預后良好，癥狀可能在1歲時自行消退，但越來越多預后不良的病例相繼被報道，張建玲等[15]曾報道1例以肝硬化腹腔積液起病的NICCD患兒。本研究23例中，隨訪的21例患兒病情均于1歲內(nèi)好轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)氨酶及膽紅素水平正常，無生長發(fā)育落后，其中2例患兒存在飲食偏好，關于病情是否進一步發(fā)展至Citrin蛋白缺乏癥導致的FTTDCD還需進一步隨訪監(jiān)測。存在肝外畸形的5例患者轉(zhuǎn)歸亦良好，目前未找到肝外畸形影響預后的直接證據(jù)。

綜上所述，NICCD在嬰兒膽汁淤積癥中并不少見，臨床醫(yī)師需加強重視，對于臨床上高度懷疑的病例應盡快行血尿遺傳代謝性篩查，必要時完善基因檢測。早期診斷，及時干預，同時對于1歲內(nèi)病情緩解的患兒亦需長期進行隨訪，避免發(fā)展至FTTDCD甚至是CTLN2。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：劉文雯負責課題設計，資料分析，撰寫論文；馬昕、王美娟、寧慧娟參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；鐘雪梅負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。