黃秀紅，謝肖立，姜慧卿

河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，石家莊 050000

肝細胞癌(HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排第6位，致死率排第4位，世界衛(wèi)生組織估計，截至2030年，全球每年將有超過100萬死于HCC的患者[1-2]。由于HCC起病隱匿，進展迅速且異質(zhì)性高，盡管外科手術、射頻消融、化學栓塞甚至肝移植已廣泛用于HCC治療，但HCC患者的存活率仍然較低[3-4]。由于與HCC發(fā)生和發(fā)展有關的生物學過程非常復雜，迄今為止尚無敏感高效的預后生物標志物，因此，有必要探索新的能夠高效預測HCC預后的生物標志物或模型，用于HCC的診斷、預后和治療。

微RNA(microRNA,miRNA)是一類參與mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼小RNA，通過與目標mRNA的3′非編碼區(qū)結合，抑制轉(zhuǎn)譯或降解mRNA，繼而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達，從而影響細胞生物學功能，miRNA的差異表達在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用[5-6]，而且多項研究[7-9]已經(jīng)確定miRNA模型能夠預測惡性腫瘤患者的預后，比如乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌。而在本次研究中，首先從TCGA中下載HCC基因及臨床數(shù)據(jù)，隨后找出與HCC預后相關的miRNA，構建預測HCC預后的miRNA風險評分模型，并驗證其檢驗效能。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與整理 從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載HCC miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。

1.2 差異分析 利用R語言的limma包對HCC與正常肝組織之間的miRNA進行基因差異表達對比分析，并設置差異倍數(shù)log2FC(fold change，F(xiàn)C)>1.0且P<0. 01。

1.3 miRNA風險評分模型的構建 從臨床數(shù)據(jù)中提取生存信息，包括生存時間和生存狀態(tài)，與差異表達的miRNA進行整合，利用R語言caret包將其隨機分成訓練集和測試集，利用survival、glmnet、survminer包對訓練集進行單因素Cox回歸分析，并設定P<0.01為差異具有統(tǒng)計學意義。然后通過10倍交叉驗證的LASSO-Cox回歸分析進一步篩選預后miRNA，并計算每個miRNA的危險比(HR)和回歸系數(shù)，基于miRNA表達水平及回歸系數(shù)的線性組合構建與HCC預后相關的風險評分模型。

1.4 miRNA風險評分模型的驗證 根據(jù)風險評分模型計算出訓練集中每個樣本的風險得分，并根據(jù)中位風險得分值將樣本分為高風險組和低風險組，采用log-rank檢驗的Kaplan-Meier生存曲線評估高風險組與低風險組的預后差異，組間差異比較時設定P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，同時在測試集中評估其穩(wěn)健性。為了評估該模型是否可以預測同一臨床分期的患者預后，對不同TNM分期的患者進行了分層分析，將HCC患者分為低TNM組(Ⅰ和Ⅱ期)和高TNM組(Ⅲ和Ⅳ期)，同樣采用log-rank檢驗的Kaplan-Meier生存曲線評估高TNM組和低TNM組的預后差異，并設定P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.5 miRNA風險評分模型的評估 通過R語言的survival ROC包繪制ROC曲線，計算出ROC曲線下面積(AUC)，并與傳統(tǒng)TNM分期比較，評估該模型的預測準確性，其中AUC> 0.7被認為具有良好的預測效能。最后對風險評分模型和臨床特征進行單因素和多因素Cox回歸分析評估該模型預后獨立性，并設定P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 miRNA樣本共425例，包括375例HCC樣本及50例癌旁樣本，并將臨床數(shù)據(jù)中生存時間、生存狀態(tài)及TNM分期缺失的數(shù)據(jù)刪除，獲得臨床數(shù)據(jù)352例(表1)。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫HCC患者的臨床數(shù)據(jù)

2.2 差異表達的miRNA 利用R語言對HCC及癌旁組織進行miRNA差異表達分析，以log2FC>1.0 且P<0.01 為標準，共篩選出300個差異表達miRNAs，上調(diào)基因260個，下調(diào)基因40個。

2.3 miRNA風險評分模型的構建 將差異表達的miRNA與臨床數(shù)據(jù)進行整合匹配，共得到347個樣本，利用R語言將其按照1∶1隨機分成訓練集(n=175)和測試集(n=172)，對訓練集依次進行單因素Cox及10倍交叉驗證的LASSO-Cox回歸分析。單因素Cox回歸分析顯示，23個miRNAs與HCC預后相關(P<0.01)。然后通過LASSO回歸進一步篩選miRNA，結果顯示9個miRNAs: hsa-miR-139-5p、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-4652-5p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-122b-5p、hsa-miR-3677-5p、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p與HCC預后顯著相關(圖1)。

最后將LASSO回歸篩選出的miRNAs擬合到多因素Cox回歸分析，最終確定了包括hsa-miR-139-5p、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p在內(nèi)的6個miRNAs，構建風險評分公式并繪制森林圖(圖2)。風險評分公式：hsa-miR-139-5p×(-0.001 07)+hsa-miR-1180-3p×0.001 57+hsa-miR-1269b×0.000 26+hsa-miR-3680-3p×0.162 79+hsa-miR-509-3-5p×0.002 46+hsa-miR-31-5p×0.010 67，計算每個樣品的風險得分。在這些miRNAs中，hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p的系數(shù)為正，表明這些基因表達水平越高，生存期越短，而hsa-miR-139-5p的系數(shù)為負，表明該基因表達水平越高，生存期越長。

2.4 miRNA風險評分模型的驗證 根據(jù)miRNA風險評分模型，計算訓練集中每個樣本的風險得分，再根據(jù)中位風險得分值(n=0.918 637 4)將訓練集分為高風險組(n=87)和低風險組(n=88)。生存曲線顯示(圖3a)高風險組患者的生存率明顯低于低風險組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同樣地，根據(jù)相同的風險評分模型及中位風險得分值(n=0.918 637 4)，將測試集中的患者分為高風險組(n=81)和低風險組(n=91)，生存曲線顯示(圖3b)，高風險組患者的生存率明顯低于低風險組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：a，LASSO篩選與生存相關的miRNAs；b，與HCC患者預后相關的miRNAs的LASSO系數(shù)。

注：**,P<0.01；***,P<0.001。

隨后根據(jù)樣本的風險得分排名，分別繪制訓練集和測試集的風險圖、生存狀態(tài)圖及與HCC預后相關的6個miRNAs的風險熱圖(圖4、5)。結果表明高風險評分的患者預后較差，且系數(shù)為正的miRNAs(hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p)表達上調(diào)，而低風險評分的患者預后較好，且系數(shù)為負的miRNA(hsa-miR-139-5p)表達上調(diào)。

注：a，訓練集生存曲線；b，測試集生存曲線。

將患者按TNM分期分為低TNM組(Ⅰ和Ⅱ期)和高TNM組(Ⅲ和Ⅳ期)，Kaplan-Meier曲線顯示低TNM組、高TNM組的高風險患者的生存率顯著低于低風險患者(P<0.05)，表明該模型可以預測同一臨床分期的患者預后。

注：a，訓練集風險圖；b，訓練集生存狀態(tài)圖；c，訓練集風險熱圖

注：a，測試集風險圖；b，測試集生存狀態(tài)圖；c，測試集風險熱圖。

2.5 miRNA風險評分模型的評估 利用R語言繪制miRNA模型及TNM分期的ROC曲線并計算AUC，結果顯示訓練集(圖7a)中，miRNA模型及TNM分期的AUC分別為0.817、0.667，測試集(圖7b)分別為0.808、0.665，及合集樣本(圖7c)分別為0.814、0.663，miRNA模型預測準確性均優(yōu)于TNM分期。

將年齡、性別、腫瘤分級、TNM分期、miRNA評分分別進行單因素、多因素Cox獨立預后分析，單因素分析結果顯示T分期、M分期、TNM分期及miRNA評分是HCC患者預后的相關因素(P值均<0.05)(圖8a)，多因素分析結果顯示miRNA評分模型可作為HCC的獨立預后因子(P<0.05)(圖8b)。

注：a，低TNM組(Ⅰ和Ⅱ期)生存曲線；b，高TNM組(Ⅲ和Ⅳ期)生存曲線。

注：a，miRNA模型和TNM分期在訓練集的ROC曲線；b，miRNA模型和TNM分期在測試集的ROC曲線；c，miRNA模型和TNM

注：a，單因素分析；b，多因素分析。

3 討論

原發(fā)性肝癌是常見的惡性腫瘤，在各個年齡段均可發(fā)病，發(fā)病率和死亡率比較高，預后很差。目前，用于預測HCC預后主要依據(jù)傳統(tǒng)的TNM分期[10]，盡管TNM分期在惡性腫瘤的診斷和治療中起著重要作用，但由于腫瘤的異質(zhì)性和個體差異，其無法反映內(nèi)部的生物學過程和疾病進展，因此有必要尋找一種新的能夠高效預測HCC預后的生物標志物或模型，輔助臨床工作。

在本次研究中，首先從TCGA中下載HCC的miRNA表達量及臨床數(shù)據(jù)，TCGA是由美國國立衛(wèi)生研究院支持發(fā)起的，包括30多種癌癥，旨在提供不同癌癥的全面基因分析并建立與臨床結果的相關性，這些數(shù)據(jù)對于癌癥的研究具有巨大的潛力，并且已經(jīng)利用這些數(shù)據(jù)取得了許多成果[11-16]。當作者試圖從訓練集中確定預后特征時，由于樣本量小，基因數(shù)量眾多，因此對訓練集中的數(shù)據(jù)進行了10倍交叉驗證的LASSO-Cox回歸分析。其中LASSO是一種創(chuàng)新的回歸變量選擇方法，在系數(shù)的絕對值之和小于一個常數(shù)的情況下將殘差平方和最小化，從而使某些回歸系數(shù)嚴格等于0，從而選擇出對因變量影響較大的自變量，是通過構造一個懲罰函數(shù)得到一個較為精煉的模型[17]，從而減少模型的過度擬合。而交叉驗證法是比較常用的推測估計懲罰系數(shù)λ的方法，而λ值最終是由使平均交叉驗證誤差最小的最小化λ確定的。然后根據(jù)Cox多因素回歸分析，得出和HCC預后相關的6種miRNAs。通過回顧已發(fā)表的文獻[18-20]，作者發(fā)現(xiàn) miRNA的失控與HCC的發(fā)生、耐藥、預后相關，廣泛參與HCC中腫瘤抑制基因的失活和癌基因的激活。其中hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p的表達在HCC組織中上調(diào)，可能起致癌作用，hsa-miR-139-5p在HCC組織中的表達下調(diào)，可能起抑癌作用，而hsa-miR-139-5p可以通過減少SLITRK4的表達抑制HCC細胞的生長[21]。然后基于回歸系數(shù)構建了風險評分模型，計算出訓練集中每位患者的風險得分，然后根據(jù)中位風險得分值將其分為高風險組和低風險組，并在測試集中驗證了該miRNA風險評分模型的預后價值。生存曲線分析表明，訓練集、測試集的高風險組和低風險組的生存曲線均觀察到明顯的分離(P值均<0.05)。為了檢驗該模型預測效能，繪制了ROC曲線，并計算了相應的AUC，將其與傳統(tǒng)TNM分期比較，結果顯示在訓練集、測試集及合集樣本中miRNA模型的預測準確性均優(yōu)于TNM分期。最后將年齡、性別、分級、分期、miRNA評分模型分別進行單因素、多因素Cox獨立預后分析，結果顯示該miRNA評分模型可作為HCC的獨立預后因子。該模型與傳統(tǒng)TNM分期相比較，能夠更好地反應內(nèi)在生物學進程和疾病進展，受主觀因素影響少，且該預測模型具有可評估性和可重復性等優(yōu)點，可與傳統(tǒng)TNM分期互補，共同應用于臨床工作。同時本研究也有一定的不足，所有分析均通過TCGA數(shù)據(jù)庫完成，以后可同時設置內(nèi)部驗證集和外部驗證集(如GEO數(shù)據(jù)庫)驗證該模型預測準確性，而且未進行相關實驗，這些都有待進一步研究工作。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明:黃秀紅負責醞釀和設計實驗，下載、分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析，論文撰寫；謝肖立負責協(xié)助論文修改；姜慧卿負責研究指導、論文修改。