張 瓔，成若晨，郭 蕊，王 霞，劉凱歌

1 西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，西安 710038； 2 西安醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院1625班，西安 710068；3 咸陽市中心醫(yī)院 老年病科，陜西 咸陽 712000； 4 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，西安 710077

慢性乙型肝炎(CHB)是常見的慢性、進(jìn)行性肝病，其發(fā)病率高，CHB可進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化(LC)甚至肝細(xì)胞癌(HCC)。我國(guó)LC和HCC 患者由HBV所致者分別為77%和84%[1]，死亡率高。因此，延緩及阻斷肝病進(jìn)展對(duì)改善預(yù)后至關(guān)重要，其關(guān)鍵是肝損傷的早期預(yù)警、評(píng)估及治療。目前各臨床檢測(cè)指標(biāo)均有一定的局限性，進(jìn)一步尋找新的指標(biāo)具有重要意義。原卟啉Ⅸ(protoporphyrins Ⅸ，PPⅨ)是血紅素生物合成途徑的最終中間體，其水平變化與肝臟疾病關(guān)系密切[2]。本研究擬通過探討PPⅨ檢測(cè)在HBV相關(guān)慢性肝病患者肝損傷中的價(jià)值，以期為HBV相關(guān)慢性肝病的診治提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究病例組為2018年10月—2019年10月就診于西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院診斷為HBV相關(guān)慢性肝病患者110例，其中CHB患者50例，LC患者40例，HCC患者20例。CHB患者根據(jù)轉(zhuǎn)氨酶是否升高進(jìn)一步分為靜止期(轉(zhuǎn)氨酶正常)與活動(dòng)期(轉(zhuǎn)氨酶升高)，LC患者根據(jù)Child-Pugh評(píng)分分為代償期(Child-Pugh A級(jí))與失代償期(Child-Pugh B、C級(jí))。納入標(biāo)準(zhǔn)：參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)原發(fā)性卟啉病、繼發(fā)性卟啉病非肝臟因素(如鉛中毒、巴比妥、磺胺、卡馬西平及其他非甾體類抗炎藥、雌激素等導(dǎo)致者；(2)合并嚴(yán)重心、腦、腎、肺、血液、內(nèi)分泌等原發(fā)疾病者；(3)非HBV感染的慢性肝病，如非酒精性脂肪肝、酒精性肝病、藥物性肝炎、丙型肝炎、自身免疫性肝病、血吸蟲性肝病等；(4)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等自身免疫性疾病。對(duì)照組為同一時(shí)期在本院健康體檢人群40例，經(jīng)檢查均無HBV感染，肝功能均在正常范圍，也無其他疾病。

1.2 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

1.2.1 常規(guī)檢查 常規(guī)檢查均在本院完成，包括HBV血清標(biāo)志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)、HBV DNA定量、AFP、血常規(guī)、肝功能、凝血功能等指標(biāo)。肝膽胰脾彩超、FibroScan、腹部CT、胃十二指腸鏡等檢查均由操作熟練、經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師完成。

1.2.2 血清PPⅨ檢測(cè) 血清樣品來自于西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，禁食、禁水12 h后，清晨空腹采集5 ml外周靜脈血避光離心，取上清液分裝于1.5 ml避光EP管中-80 ℃凍存。采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)血清PPⅨ，在西安醫(yī)學(xué)院藥物分析測(cè)試中心完成。

(1)主要儀器及試劑：安捷倫1260 HPLC儀、配套二元泵、熒光檢測(cè)器以及數(shù)據(jù)處理軟件工作站(Agilent，美國(guó))。PPⅨ標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)。

(2)色譜條件：美國(guó)Agilent 5 TC-C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm),柱溫30 ℃；流動(dòng)相 A純凈水(含0.5%冰乙酸)，B甲醇∶乙腈∶DMF=45∶45∶10，以B∶A=95∶5等度洗脫。流速1 ml/min，激發(fā)波長(zhǎng)400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)630 nm,增益16。

(3)PPⅨ標(biāo)準(zhǔn)品混合液配置：精密稱取PPⅨ標(biāo)準(zhǔn)品1 mg溶于1 ml DMF溶液中配置濃度為1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再逐級(jí)稀釋至濃度分別為100、70、30、10、7、3、1 ng/dl，作為實(shí)驗(yàn)中測(cè)定血清中PPⅨ的校正集。

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：按上述色譜條件及稀釋濃度進(jìn)行分析，每次進(jìn)樣20 μl，連續(xù)進(jìn)樣3次取平均峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(ng/dl)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.246 4X+0.308 6，R2=0.999 8，最低檢測(cè)濃度0.1 ng/dl，標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)范圍：1～100 ng/dl。

(5)血樣處理及檢測(cè)：解凍血漿樣品300 μl加700 μl甲醇定容至1 ml，震蕩，高速冷凍離心后取上清液進(jìn)行含量測(cè)定，每份樣品進(jìn)樣3次取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算被檢者血清PPⅨ。HPLC法檢測(cè)PPⅨ標(biāo)品、血樣出峰圖像如下(圖1)。

注：a，原卟啉Ⅸ標(biāo)準(zhǔn)品；b，對(duì)照組；c，病例組。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：XYYFY2021LSK-002，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 基本資料的比較 CHB組、LC組、HCC組與對(duì)照組在性別、年齡上比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 患者基本資料的比較

2.2 各組血清PPⅨ檢測(cè)結(jié)果 (1)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)顯示，CHB、LC、HCC 3組肝病患者血清PPⅨ顯著高于對(duì)照組[44.29(25.99～85.36)ng/dl、72.73(48.28～90.43)ng/dl、91.79(68.34～121.52)ng/dl vs 15.43(10.87～20.16)ng/dl]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。HCC組較CHB、LC組PPⅨ顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖2)。(2)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)顯示，與代償期LC患者相比較，失代償期LC患者PPⅨ顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而CHB患者活動(dòng)期與靜止期PPⅨ比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

圖2 對(duì)照組與病例組血清PPⅨ水平

表2 CHB與LC患者組內(nèi)PPⅨ水平

2.3 PPⅨ診斷HBV相關(guān)慢性肝病的效能 ROC曲線顯示，PPⅨ診斷CHB的曲線下面積(AUC)為0.873，95%CI：0.797～0.949，利用約登指數(shù)確定臨界值為20.325ng/dl，其敏感度為86%，特異度為77.5%；診斷LC的AUC為0.748，95%CI：0.659～0.838，臨界值為33.695 ng/dl，其敏感度為90%，特異度為61.1%；診斷HCC的AUC為0.812，95%CI：0.729～0.896，臨界值為65.26 ng/dl，其敏感度為85%，特異度為69.2%(圖3)。

注：a，PPⅨ診斷CHB的ROC曲線；b，PPⅨ診斷LC的ROC曲線；c，PPⅨ診斷HCC的ROC曲線。

2.4 CHB靜止期與對(duì)照組PPⅨ及肝功能比較 靜止期CHB患者肝功能指標(biāo)除ChE較健康對(duì)照組升高外(P=0.032)，其余指標(biāo)與對(duì)照組相比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)；而CHB患者的PPⅨ顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 CHB患者靜止期與對(duì)照組PPⅨ及肝功能指標(biāo)比較

2.5 PPⅨ與各肝功能評(píng)估指標(biāo)的相關(guān)性分析 CHB患者PPⅨ與各指標(biāo)均不存在相關(guān)性(P值均>0.05)；LC患者PPⅨ與TBil呈中等正相關(guān)(rs=0.587，P<0.05)，與Alb呈中等負(fù)相關(guān)(rs=-0.408，P<0.05)；HCC患者PPⅨ與TBil呈中等正相關(guān)(rs=0.470，P<0.05)，與ChE呈中等負(fù)相關(guān)(rs=-0.459，P<0.05)(表4)。

表4 PPⅨ與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

HBV感染是全球最重大公共衛(wèi)生安全問題之一，可進(jìn)展為CHB甚至LC、HCC等終末期肝病，給患者和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)，同時(shí)擠占大量的醫(yī)療資源。而早期預(yù)防及治療，對(duì)于阻止疾病進(jìn)展及改善預(yù)后具有重要意義。CHB的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，目前認(rèn)為肝細(xì)胞損害主要是由HBV引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)所導(dǎo)致[1]。此外，HBV誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激、線粒體自噬以及釋放炎性因子可能是肝病進(jìn)展的重要原因[4]。PPⅨ是血紅素生物合成途徑的最終中間體，起始和終末兩個(gè)關(guān)鍵步驟均在肝細(xì)胞線粒體進(jìn)行[2]，遺傳性和后天性疾病以及某些外源生物可能干擾血紅素的合成和PPⅨ的體內(nèi)平衡，導(dǎo)致PPⅨ的蓄積[5]。大量的PPⅨ具有肝毒性，損害肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，肝細(xì)胞損傷后肝臟對(duì)PPⅨ的清除作用進(jìn)一步減弱，血漿和紅細(xì)胞中PPⅨ水平可逐漸升高[5]。研究[6]表明，HBV或許影響肝細(xì)胞內(nèi)PPⅨ代謝和血紅素合成，而PPⅨ與HBV相關(guān)慢性肝病進(jìn)展的關(guān)系及其能否用于肝損傷的早期預(yù)警及病情評(píng)估鮮有報(bào)道。

本研究利用HPLC法，高效、高靈敏的檢測(cè)了對(duì)照組和慢性肝病患者的血清PPⅨ。結(jié)果顯示，在HBV感染者疾病進(jìn)程的不同階段均存在PPⅨ表達(dá)異常。與對(duì)照組相比，肝病患者的PPⅨ顯著升高，這與以往的研究結(jié)果一致[7-9]，也驗(yàn)證了該方法的有效性。Nakano等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HCV核心蛋白可以增加貓白血病病毒C亞類受體1(feline leukemia virus subgroup C receptor 1, FLVCR1)和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP結(jié)合盒G家族成員2(ATP-binding cassette subfamily G member 2, ABCG2)的mRNA表達(dá)，降低ATP結(jié)合盒B家族成員6(ATP-binding cassette subfamily B member 6, ABCB6)的mRNA表達(dá)，HBV核心蛋白同樣如此[6]。FLVCR1是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促進(jìn)因子超家族成員，可以輸出血紅素和PPⅨ[11]；ABCG2主要定位于細(xì)胞外膜和線粒體膜，負(fù)責(zé)PPⅨ的外排；而ABCB6是線粒體卟啉攝取所必需的[12]，其表達(dá)水平直接影響細(xì)胞內(nèi)的PPⅨ濃度[13]。HBV感染者血清中PPⅨ升高可能是HBV核心蛋白通過增加卟啉轉(zhuǎn)運(yùn)體FLVCR1和 ABCG2的表達(dá)，降低ABCB6的表達(dá)，使PPⅨ從肝細(xì)胞輸出增加，輸入減少，導(dǎo)致血漿中PPⅨ水平升高。同時(shí)，HBV可引起線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激[6,14]，導(dǎo)致血紅素合成障礙和PPⅨ的蓄積，造成肝細(xì)胞損害。血紅素合成減少負(fù)反饋引起卟啉合成限速酶氨基 γ 酮戊酸合成酶1的增加，又加速了PPⅨ的合成。肝細(xì)胞損害也使PPⅨ的清除能力下降，肝腸循環(huán)增加，導(dǎo)致血清中PPⅨ水平進(jìn)一步升高。

PPⅨ增減與肝病輕重，特別是肝損傷程度密切相關(guān)[7]，血清PPⅨ還可能與慢性肝病進(jìn)展呈活動(dòng)度依賴性，CHB患者活動(dòng)期與靜止期PPⅨ相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與納入CHB患者肝損傷普遍較輕及樣本量較小有關(guān)。與代償期LC患者相比，失代償期患者肝功能嚴(yán)重受損，PPⅨ水平也顯著升高，說明PPⅨ檢測(cè)不但能反映肝損傷，還能幫助判斷病情進(jìn)展情況。本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者PPⅨ較CHB、LC患者均顯著增加，說明HCC時(shí)卟啉代謝紊亂較慢性肝病更為突出。線粒體功能障礙已被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志[15]，肝癌患者PPⅨ顯著升高可能是因?yàn)榫€粒體功能障礙引起氧化應(yīng)激從而干擾卟啉代謝和血紅素的生成。也有學(xué)者[9]認(rèn)為可能是惡性腫瘤刺激機(jī)體卟啉代謝的某個(gè)限速酶，使其活性增強(qiáng)，產(chǎn)生大量PPⅨ超過了機(jī)體對(duì)其的利用，導(dǎo)致血中PPⅨ水平顯著升高。

研究[7,16]證實(shí)HBV感染者PPⅨ水平與肝病進(jìn)展相關(guān)，但目前僅有一項(xiàng)研究[9]調(diào)查了PPⅨ在HCC患者中的診斷價(jià)值，PPⅨ能否作為CHB、LC和HCC鑒別診斷的潛在標(biāo)志物，目前尚未闡明。本研究通過ROC曲線分析顯示，當(dāng)PPⅨ取最佳臨界值20.325、33.695、65.26 ng/dl時(shí)，采用PPⅨ診斷CHB、LC和HCC的敏感度均在85%以上，特異度均在60%以上，說明PPⅨ對(duì)HBV相關(guān)慢性肝病診斷的敏感度較高，但特異度特差，因此PPⅨ不具備診斷價(jià)值。進(jìn)一步對(duì)靜止期CHB患者和對(duì)照組的PPⅨ水平和肝功能指標(biāo)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，靜止期CHB患者肝功能指標(biāo)與對(duì)照組相比，無明顯變化，而PPⅨ水平顯著高于健康對(duì)照組，提示PPⅨ是肝損傷的早期事件。在慢性HBV感染時(shí)，HBV最早損傷肝細(xì)胞線粒體，作為PPⅨ代謝的主要細(xì)胞器，線粒體的損傷影響了PPⅨ的正常代謝，此時(shí)肝細(xì)胞的其他亞細(xì)胞器未損傷，表現(xiàn)為膽紅素、轉(zhuǎn)氨酶等反映肝損傷的指標(biāo)均正常，而血清PPⅨ異常。因此PPⅨ是反映肝臟早期輕微損傷的敏感指標(biāo)，具有作為HBV肝損傷的早期預(yù)警潛質(zhì)，可能用于急性、活動(dòng)性、慢加急性肝損傷或肝衰竭等的預(yù)警、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后評(píng)估。

Spearman相關(guān)性分析表明PPⅨ水平可能與肝功能障礙和膽汁淤積的程度有關(guān)，這與國(guó)外學(xué)者的報(bào)道相一致[8,17]。HBV損傷肝細(xì)胞，使膽紅素和PPⅨ攝取、代謝和排泄能力降低，血清中膽紅素和PPⅨ水平升高。血清中的PPⅨ既有游離態(tài)的，又存在和蛋白質(zhì)結(jié)合形式的，血清白蛋白能夠作為PPⅨ的載體參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[18]。卟啉轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FLVCR1輸出血紅素受到細(xì)胞外血紅素結(jié)合蛋白和Alb的嚴(yán)格控制，在缺乏載體蛋白的情況下FLVCR不能輸出血紅素[11]。本研究LC和HCC組PPⅨ顯著升高，可能與患者Alb合成減少，輸出血紅素亦減少導(dǎo)致PPⅨ的蓄積有關(guān)，也說明PPⅨ可作為肝損傷的評(píng)估指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)HBV感染者PPⅨ不與ALT、AST呈顯著的相關(guān)性，這可能與ALT、AST僅在肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯炎癥及壞死時(shí)才升高有關(guān)，也可能是反映肝損傷的不同發(fā)病機(jī)理或不同分子通路。

綜上所述，HBV相關(guān)慢性肝病患者血清PPⅨ顯著升高，且與慢性肝病進(jìn)展呈活動(dòng)度依賴性，可作為肝損傷的早期預(yù)警和病情評(píng)估的潛在臨床指標(biāo)，對(duì)評(píng)價(jià)肝損傷程度、判斷肝臟儲(chǔ)備功能、協(xié)助慢性肝病診治具有一定的臨床意義。同時(shí)，由于本研究樣本量較小和樣本的局限性，其結(jié)果推廣應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張瓔、成若晨負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；郭蕊、王霞參與收集數(shù)據(jù)與樣本檢測(cè)；劉凱歌負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。