董 坤，陳 玲，盧 俊，張曉玲，鄭立飛,4，楊柱瓊，余學(xué)堂，曾黎瓊

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院富源魔芋研究所，云南 富源 655500；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223； 3.威信縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南 昭通 657900；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201）

魔芋是天南星科多年生草本植物，其球莖中含有大量葡甘露聚糖，該物質(zhì)具有高吸水性和高膨脹性，在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。中國(guó)是魔芋的原產(chǎn)地之一，栽培和利用魔芋歷史悠久。云南省特有的地形和氣候條件，是發(fā)展魔芋產(chǎn)業(yè)的適宜 區(qū)域[1-2]。尤其是近年來(lái)，隨著國(guó)家鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的實(shí)施，魔芋產(chǎn)業(yè)成為山區(qū)扶貧的重要項(xiàng)目之一，農(nóng)民種植魔芋的積極性日益高漲。目前，關(guān)于魔芋的研究多集中在栽培技術(shù)[3-5]、病蟲(chóng)害防治[6-7]等方面。也有學(xué)者就魔芋的形態(tài)學(xué)開(kāi)展了一系列研究[8-10]，制定了相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[11]，為魔芋種質(zhì)資源的鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)。在分子標(biāo)記方面，RAPD、AFLP、ISSR等技術(shù)都被應(yīng)用于魔芋種質(zhì)資源研究[12-16]，為魔芋屬植物分類以及種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析提供了依據(jù)。筆者利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)富源縣金地魔芋種業(yè)有限公司收集和自育的15 份魔芋資源的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，旨在為不同魔芋資源的鑒定及其開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

15 份魔芋資源編號(hào)為1～15 號(hào)，其中，1、5～7、11 號(hào)來(lái)源于云南富源，2 號(hào)來(lái)源于云南普洱，3 號(hào)來(lái)源于云南楚雄，4 號(hào)來(lái)源于云南文山，8 號(hào)（遠(yuǎn)雜1 號(hào)）來(lái)源于湖北恩施，9、12 號(hào)來(lái)源于云南臨滄，10、13、14、15 號(hào)分別來(lái)源于云南會(huì)澤、貴州威寧、云南昭通、云南瀘西。收集后于2019 年種植在富源縣金地魔芋種業(yè)有限公司魔芋種植基地。

1.2 調(diào)查方法

參考NT-T2500—2013 植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 魔芋觀測(cè)記錄魔芋植株葉柄、葉片、球莖、花、果的形態(tài)特征。播種時(shí)測(cè)定種芋重量，膨大期測(cè)量其株高、葉柄周長(zhǎng)、葉柄長(zhǎng)度、開(kāi)展度，倒苗后挖出球莖測(cè)定其重量。

1.3 ISSR 分析

采用Magen（美基）生物公司DNA 提取試劑盒提取供試材料單株葉片基因組DNA。DNA 純化后用0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，以確定其質(zhì)量。利用紫外分光光度計(jì)將DNA 濃度調(diào)整為10 ng/μL，存于-20℃冰箱備用。

PCR 反應(yīng)體系總體積為15 μL：天根2×Taq PCR MasterMPCR 7.5 μL，引物（10 μmol/L）1 μL（所用引物由上海生工合成，詳見(jiàn)表1），模板DNA（10 ng/μL）2 μL，ddH2O 4.5 μL，最后加1 滴石蠟油防止蒸發(fā)。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50～55℃復(fù)性30 s（溫度因引物不同而異，具體溫度如表1 所示），72℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上以5 V/cm 恒壓電泳，選用DL 1 000 marker （寶生物工程大連有限公司）作為對(duì)比，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 和SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析比較；運(yùn)用Popgeng-32 軟件計(jì)算各材料間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，并進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋資源的生物學(xué)特性

表1 ISSR 引物名稱，序列及其退火溫度

15 份魔芋資源的形態(tài)特征詳見(jiàn)圖1 和表2。1、3、15、5、13、9 號(hào)樣品具有花魔芋形態(tài)特征，它們的主要區(qū)別在于葉柄主色、葉柄斑紋顏色和形狀的不同。1、3、15、5、13、9 號(hào)樣品球莖肉色都為白色，其中15號(hào)樣品白色球莖肉色中有紅絲，與其他樣品明顯不同。1、3、15、13、9 號(hào)魔芋的肉穗狀花序長(zhǎng)度高于佛焰苞位置；5 號(hào)魔芋的肉穗狀花序長(zhǎng)度約等于佛焰苞位置。6、7、14、8 號(hào)樣品具有白魔芋形態(tài)特征，植株較矮小，主要區(qū)別是葉柄主色、葉柄斑紋形狀和顏色不同。6 號(hào)魔芋葉柄綠色，細(xì)小點(diǎn)狀灰白色斑紋；7號(hào)魔芋葉柄綠色，塊狀斑紋；14 號(hào)魔芋葉柄綠色，點(diǎn)狀斑紋；8 號(hào)魔芋葉柄淺粉紅色，塊狀墨綠色斑紋。2號(hào)魔芋植株相對(duì)較大，球莖肉色為黃色，附屬器淺紫色且有皺褶，果序?yàn)樗{(lán)色，鑒定為勐海魔芋。4 號(hào)魔芋植株分叉處有株芽，植株較大，球莖肉色為粉紅色，佛焰苞內(nèi)側(cè)紅色，外側(cè)粉紅色，果序?yàn)槌燃t色，是一種珠芽魔芋。10 號(hào)魔芋和11 號(hào)魔芋鑒定為滇魔芋，主要區(qū)別是葉柄和葉柄斑顏色不同，11 號(hào)魔芋的葉柄主色更深，斑點(diǎn)更多，果序?yàn)樗{(lán)色。12 號(hào)魔芋植株較大，叢生性強(qiáng)，球莖上芽點(diǎn)較多，根系發(fā)達(dá)，球莖肉色為橙色，鑒定為甜魔芋，開(kāi)花后干枯死亡，未見(jiàn)結(jié)子。

圖1 15 份魔芋相關(guān)器官的形態(tài)特征

表2 樣品來(lái)源及形態(tài)比較

2.2 魔芋植株的長(zhǎng)勢(shì)

如表3 所示，2、4 號(hào)魔芋的平均株高、葉柄長(zhǎng)、開(kāi)展度、葉柄周長(zhǎng)數(shù)值較大，6、7、8、14 號(hào)魔芋的平均株高、葉柄長(zhǎng)、開(kāi)展度、葉柄周長(zhǎng)數(shù)值較??；生長(zhǎng)系數(shù)最大的是5 號(hào)魔芋，為5.78。

2.3 ISSR 分析

提取15 份魔芋葉片基因組DNA 進(jìn)行了ISSR分析。從41 條引物中篩選出31 條引物可擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定、重復(fù)性好、多態(tài)性高的條帶，圖2 為引物UBC822 的電泳圖譜。結(jié)果顯示，以15 份魔芋葉片基因組DNA 作為模板，31 條引物共擴(kuò)增出490 條DNA帶，其中多態(tài)性條帶共489 條，占99.80%。

利用Popgen 32 軟件計(jì)算不同魔芋材料間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)，15 份魔芋材料之間的遺傳相似系數(shù)在0.555 1～0.942 9，遺傳距離在0.058 8～0.588 6，其中1 號(hào)花魔芋與3 號(hào)花魔芋之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.942 9，遺傳距離最小，為0.058 8；3 號(hào)花魔芋與11 號(hào)滇魔芋芋之間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.555 1，遺傳距離最大，為0.588 6。聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖3，15 份魔芋材料在遺傳相似系數(shù)為0.69 的位置處分成6 大類：第一類包括1、3、15、5、13、9 號(hào)樣品，具有花魔芋形態(tài)特征；第二類包括6、7、14、8 號(hào)樣品，具有白魔芋形態(tài)特征；第三類包括2 號(hào)樣品（勐海魔芋）；第四類包括4 號(hào)樣品（珠芽魔芋）；第五類包括10、11 號(hào)樣品，具有滇魔芋的形態(tài)特征；第六類包括12 號(hào)樣品，具有甜魔芋的形態(tài)特征。可見(jiàn)，15 份魔芋的遺傳聚類與形態(tài)外觀調(diào)查分析結(jié)果基本一致。

表3 15 份魔芋材料的生長(zhǎng)情況

圖2 ISSR 分析電泳圖（引物UBC822）

表4 15 份魔芋材料的的遺傳相似系數(shù)（—以上）和遺傳距離（—以下）

3 小結(jié)與討論

在同樣的種植條件下觀察不同魔芋種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀，可以看出曲靖市富源縣竹園鎮(zhèn)的氣候環(huán)境不是白魔芋、勐海魔芋、珠芽魔芋、滇磨芋和甜魔芋的最佳生長(zhǎng)條件，導(dǎo)致這些魔芋植株長(zhǎng)勢(shì)稍差。從生長(zhǎng)系數(shù)看，5 號(hào)魔芋更適合在當(dāng)?shù)胤N植。

圖3 15 份魔芋材料的聚類結(jié)果

對(duì)15 份魔芋材料的葉、球莖、花、果等進(jìn)行了觀察記載和農(nóng)藝性狀分析調(diào)查，并利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)分析了它們的遺傳多樣性，聚類分析結(jié)果顯示，花魔芋、白魔芋、勐海魔芋、珠芽魔芋、滇魔芋、甜魔芋各自聚為一類，遠(yuǎn)雜1 號(hào)在遺傳上更接近于白魔芋，為今后魔芋種質(zhì)資源鑒定和保護(hù)利用提供了依據(jù)。

ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)能夠揭示植物的遺傳多態(tài)性，有效反映出品種間的親緣關(guān)系。任盤(pán)宇等[14]對(duì)云南南部5 種魔芋屬植物居群遺傳結(jié)構(gòu)的分析中，通過(guò)PCR 擴(kuò)增9 個(gè)ISSR 引物共獲得95 條條帶，其中多態(tài)性條帶占總條帶數(shù)的100%。在該研究中，15 份魔芋材料通過(guò)31 個(gè)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增共獲得490 條條帶，其中多態(tài)性條帶489 條，占總條帶數(shù)的99.80%。遺傳相似系數(shù)是比較不同品種或群體間遺傳多樣性的重要指標(biāo)。任盤(pán)宇等[14]利用ISSR 技術(shù)對(duì)云南南部5 種魔芋屬植物居群遺傳結(jié)構(gòu)分析的樣品間遺傳相似系數(shù)為0.857 1～0.473 7，宣慢[16]利用ISSR 技術(shù)對(duì)49 份魔芋屬資源的多樣性分析，其遺傳相似系數(shù)為1.00～0.68，該研究中15 份魔芋樣品間的遺傳相似系數(shù)為0.555 1～ 0.942 9，居于前二者的研究結(jié)果之間。聚類分析結(jié)果顯示，花魔芋和白魔芋的雜交品種遠(yuǎn)雜1 號(hào)的親緣關(guān)系更靠近白魔芋。滕彩珠等[17]進(jìn)行的云南魔芋種質(zhì)資源親緣關(guān)系ISSR 分析發(fā)現(xiàn)甜魔芋與花魔芋聚到一起，與該研究結(jié)果中甜魔芋（12 號(hào)樣品）與滇魔芋（10、11 號(hào)樣品）聚到一起，有所不同，可能是因?yàn)樵撗芯克x擇的ISSR 引物較少未能全面地反映二者在DNA水平上的差異所致。