朱耀磊，曲繼發(fā)，桑 雪，張公亮，畢景然，郝洪順，侯紅漫*

（1 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連116034 2 遼寧省水產(chǎn)品加工質(zhì)量安全與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧大連116034）

蜂房哈夫尼（Hafnia alvei）是革蘭陰性、運(yùn)動(dòng)、有鞭毛的兼性厭氧桿菌，可在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落一般為灰白色，呈圓形，有輕微的不規(guī)則邊緣。蜂房哈夫尼生存范圍廣泛，存在于人和動(dòng)物的糞便、河流、海洋和土壤中，在特定條件下，可引起人類多種腸道感染疾病，通常被認(rèn)為是一種條件致病菌[1-2]。

蜂房哈夫尼是真空包裝、氣調(diào)包裝食品中一種常見的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，常常造成富含蛋白質(zhì)的水產(chǎn)品、肉制品、乳制品在低溫冷藏時(shí)發(fā)生腐敗變質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，在真空包裝的紅肉和白肉制品中，哈夫尼菌屬為優(yōu)勢(shì)腐敗菌的幾率高于76%[3]。在真空包裝的肉制品中，蜂房哈夫尼菌和沙雷氏菌為主要的腐敗腸桿菌[4]。氣調(diào)包裝（MAP）的鮭魚肉低溫冷藏時(shí)，優(yōu)勢(shì)腐敗菌為蜂房哈夫尼菌[5]。南亞、東南亞地區(qū)流行的真空包裝魚糜制品中蜂房哈夫尼菌為主要致腐微生物[1]。超高溫滅菌乳在7 ℃冷藏條件下，蜂房哈夫尼菌的生長(zhǎng)速度及腐敗貢獻(xiàn)要高于熒光假單胞菌[6]。

目前關(guān)于蜂房哈夫尼菌的報(bào)道不多。本課題組一直從事海產(chǎn)品安全的研究，發(fā)現(xiàn)蜂房哈夫尼可在含鹽5%的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，在海產(chǎn)品原料及產(chǎn)品中較為常見，在海產(chǎn)品的腐敗，尤其是生物胺產(chǎn)生方面貢獻(xiàn)突出。本課題組從蝦醬中分離出3 株（G1、G4 和G5）、從魚露中分離出1 株（Y1）、從即食海參中分離出1 株（H4）蜂房哈夫尼菌。通過研究海產(chǎn)品中蜂房哈夫尼菌相關(guān)特性，進(jìn)一步明確該菌的致腐特性，更有針對(duì)性的控制該菌在海產(chǎn)品安全方面的危害作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)菌株及培養(yǎng)條件

菌種來源：分離自蝦醬（遼寧，盤錦）中的G1、G4、G5 菌株；分離自魚露（山東，威海）中的Y1 菌株；分離自腐敗即食海參的蜂房哈夫尼菌（H.alvei H4）H4 菌株；分離自腐敗大菱鲆的蜂房哈夫尼菌HA-01 由大連民族大學(xué)李婷婷副教授饋贈(zèng)。上述菌株均使用LB 培養(yǎng)基，在30 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2 試劑和儀器

結(jié)晶紫染液，上海生工生物；各類抗生素，索萊寶試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；ExTaq DNA 聚合酶，大連Takara；各類培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；賴氨酸鹽酸鹽、鳥氨酸鹽酸鹽、組氨酸鹽酸鹽、酪氨酸鹽酸鹽、色氨酸鹽酸鹽和鹽酸吡哆醛，上海Aladdin。

1260 高效液相色譜，美國(guó)安捷倫；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher；UV 2102 型紫外分光光度計(jì)，日本島津；SpectraMax M2 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MD；自動(dòng)凱氏定氮儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離、鑒定

1.3.1 菌種16S rRNA 鑒定及其系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 提取G1、G4、G5 和Y1 菌株的DNA，用16S rRNA 基因通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3’）PCR 擴(kuò)增菌株的16S rRNA 基因。反應(yīng)體系：Premix Ex Taq 酶25 μL；上下游引物各1 μL；DNA 模板1 μL，加ddH2O 至50 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析。采用Mega 6.0 軟件將6 株菌的16S rRNA 序列與GenBank 中比對(duì)后同源性較高的菌株的16S rRNA 序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[7]。

1.3.2 生理生化鑒定 試驗(yàn)方法參考《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第9 版[8]，中蜂房哈夫尼菌的鑒定方法，對(duì)G1、G4、G5 和HA-01 菌株進(jìn)行如下生理生化試驗(yàn)鑒定：革蘭氏染色、鞭毛染色、動(dòng)力實(shí)驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、糖醇類發(fā)酵、MR 試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、ONPG 試驗(yàn)和硫化氫試驗(yàn)，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 蜂房哈夫尼菌特性研究

1.4.1 生物膜 參照Pratt[9]和李婷婷[10]等學(xué)者的試驗(yàn)方法，采用96 孔板結(jié)晶紫染色法進(jìn)行測(cè)定，培養(yǎng)7 d，每24 h 測(cè)定1 次，每個(gè)菌6 個(gè)平行。金黃色葡萄球菌為陽性對(duì)照，空白LB 培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。用酶標(biāo)儀測(cè)定OD590nm吸光值。

1.4.2 泳動(dòng)性 參照Cong 等[11]和Hidalgo 等[12]學(xué)者的方法并作適當(dāng)修改，利用平板擴(kuò)散法測(cè)定各菌株的泳動(dòng)能力。將過夜培養(yǎng)的菌液用移液槍吸取3 μL 點(diǎn)到凝固的Swimming 平板的中心位置，靜置30 min 后移至30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察結(jié)果?？瞻着囵B(yǎng)基作為對(duì)照，每組3 個(gè)平行。

1.4.3 耐鹽性試驗(yàn) 將細(xì)菌分別接種到含有不同鹽質(zhì)量濃度（0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.08，0.1 g/mL） 的LB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)，觀察菌液的生長(zhǎng)狀況。每組3 個(gè)平行，LB 液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.4.4 藥敏試驗(yàn) 試驗(yàn)選擇9 種常見抗生素（氯霉素、卡那霉素、氨芐霉素、慶大霉素、壯觀霉素、克林霉素、四環(huán)素、紅霉素和鏈霉素）以及8 種水產(chǎn)品中常見的抗生素（環(huán)丙沙星、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、氧氟沙星、呋喃西林、呋喃唑酮、甲硝唑和鹽酸金霉素）。配制終質(zhì)量濃度為0～500 μg/mL 的液體和固體LB 培養(yǎng)基，30 ℃振蕩培養(yǎng)，觀察各菌株在液體LB 和固體平板上的生長(zhǎng)狀況，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，每組3 個(gè)平行。

1.4.5 TVB-N 值 分別將蜂房哈夫尼菌G1、G4和G5 菌株接種到蝦醬，HA-01 接種到大菱鲆，H4接種到即食海參，Y1 接種到魚露后，于25 ℃恒溫恒濕條件下貯藏。貯藏過程中，參照國(guó)標(biāo)GB 5009.228-2016 的方法，測(cè)定各樣品在不同貯藏時(shí)期的TVB-N 值。

1.4.6 生物胺 采用高效液相色譜法對(duì)蜂房哈夫尼菌產(chǎn)生物胺的量進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)方法參見Jeon等[13]學(xué)者的報(bào)道。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析 利用Mega 6.0 軟件制細(xì)菌進(jìn)化樹。試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用Origin Pro 8.6 軟件繪制各數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA 菌株鑒定結(jié)果

由圖1可知，PCR 產(chǎn)物電泳圖的G1、G4、G5和Y1 泳道均有1 條明亮的單一條帶，條帶長(zhǎng)度為1 500 bp 左右，測(cè)序后在NCBI 網(wǎng)站比對(duì)可知，4株菌的序列與哈夫尼菌屬的16S rRNA 序列相似率最高，均達(dá)到了97%以上，表明4 株菌均屬于哈夫尼菌屬（Hafnia sp.）。

進(jìn)化樹結(jié)果顯示，分離自蝦醬（G1、G4、G5）和魚露（Y1） 的哈夫尼菌與蜂房哈夫尼FB1、95-3、ATCC29926 和H4 型菌株處于相近分支（圖2），其中，蜂房哈夫尼FB1、95-3 和H4 菌株均分離自食品中（FB1 菌株分離自冷凍魚丸，95-3 菌株分離自零售食品，H4 菌株分離自即食海參），表明其種屬接近，同源性較高。

圖2 基于16S rRNA 序列的6 株蜂房哈夫尼細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of six H.alvei strains based on 16S rRNA gene sequences

2.2 生理生化鑒定結(jié)果

4 株菌的生理生化鑒定結(jié)果（表1）：革蘭氏染色陰性，鞭毛染色陽性，動(dòng)力實(shí)驗(yàn)陽性，氧化酶試驗(yàn)陰性，糖醇類發(fā)酵陽性產(chǎn)氣，甲基紅試驗(yàn)陽性，V-P 試驗(yàn)陰性，吲哚實(shí)驗(yàn)陽性，ONPG 試驗(yàn)陰性，硫化氫試驗(yàn)陰性，該4 株菌符合蜂房哈夫尼生理生化特性，表明該4 菌為蜂房哈夫尼菌。

2.3 蜂房哈夫尼菌特性研究

2.3.1 生物膜 由圖3可以看出，與陽性對(duì)照金黃色葡萄球菌相似，6 株蜂房哈夫尼菌在生長(zhǎng)過程中均可在96 孔板中形成生物被膜，然而6 株菌的成膜量及成膜規(guī)律不盡相同。其中G1 和G4 菌株在144 h 時(shí)生物膜量達(dá)到最大值；G5 和H4 菌株在72 h 時(shí)達(dá)到最大；HA-01 菌株在168 h 時(shí)達(dá)到最大；Y1 在96 h 時(shí)達(dá)到最大。經(jīng)測(cè)定ODc 值（陰性對(duì)照的平均值+3×陰性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)偏差）為0.163，可以看出，G4 菌株能夠形成強(qiáng)生物被膜；而HA-01 菌株的成膜能力比較弱，其它菌株則形成了中強(qiáng)度及以上的生物被膜。

2.3.2 泳動(dòng)性 由圖4可以看出，在Swimming 平板表面均出現(xiàn)1 個(gè)半透明的光暈，表明接種在平板中央的6 株蜂房哈夫尼菌可以在培養(yǎng)過程中向四周運(yùn)動(dòng)，其中G4 菌株的擴(kuò)散區(qū)域明顯較小，另外5 株菌株的擴(kuò)散區(qū)域則相差不大。表明這6 株蜂房哈夫尼均具有泳動(dòng)能力，G4 的泳動(dòng)能力小于其它5 株菌。

表1 蜂房哈夫尼細(xì)菌生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of H.alvei

圖3 30 ℃培養(yǎng)基中6 株蜂房哈夫尼菌株生物膜的形成能力Fig.3 Biofilm formation of the six H.alvei strains in LB at 30 ℃

圖4 6 株蜂房哈夫尼菌株在30 ℃下的泳動(dòng)性Fig.4 Swimming mobility of six H.alvei strains at 30 ℃

2.3.3 耐鹽性 由表2可知，從蜢蝦中分離出的3 株蜂房哈夫尼菌G1、G4、G5 和從腐敗即食海參分離出的蜂房哈夫尼菌H4 的耐鹽性均為0.05 g/mL，而分離自腐敗大菱鲆中的蜂房哈夫尼菌HA-01 和魚露中的Y1 菌株的耐鹽性為0.06 g/mL。

2.3.4 藥敏試驗(yàn) 由表3可知，從海產(chǎn)品中分離到的6 株蜂房哈夫尼菌具有廣泛的抗藥性，其中G1、G4、G5 和Y1 菌株對(duì)氨芐青霉素、壯觀霉素的抗性最強(qiáng)，分別為450，200 μg/mL，對(duì)磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的抗性分別為250，200 μg/mL。然而對(duì)氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮和鹽酸金霉素較為敏感。HA-01 菌株對(duì)氨芐青霉素、呋喃西林、甲硝唑、磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，對(duì)其余菌株對(duì)抗生素敏感。H4 菌株的抗性較另外5 株菌的抗性較弱，對(duì)磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和甲硝唑的抗性較強(qiáng)，對(duì)其余抗生素則表現(xiàn)出敏感的特性。

表2 6 株蜂房哈夫尼細(xì)菌耐鹽性試驗(yàn)Table 2 Salt tolerance test of the six H.alvei bacteria

表3 6 株蜂房哈夫尼菌株的抗性試驗(yàn)Table 3 Resistance test of six H.alvei bacterial strains

2.3.5 TVB-N 值 由圖5可知，在將蜂房哈夫尼G1、G4 和G5 菌株接種到蝦醬，HA-01 接種到大菱鲆，H4 接種到即食海參，Y1 接種到魚露后，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TVB-N 值逐漸升高，貯藏第6天時(shí)，TVB-N 值達(dá)到最大，表明樣品在貯藏過程中，逐漸發(fā)生腐敗變質(zhì)。其中接種有蜂房哈夫尼HA-01 和Y1 菌株的樣品的TVB-N 值高于G1、G4、G5 和H4 菌株，即說明HA-01 和Y1 菌株的致腐能力強(qiáng)于另外4 株蜂房哈夫尼菌。

2.3.6 生物胺測(cè)定 由圖6～8 可以看出，在檢測(cè)過程中，這6 株蜂房哈夫尼菌均可產(chǎn)生腐胺、尸胺和組胺3 種生物胺。在這3 種生物胺中，腐胺的產(chǎn)量最高，能夠達(dá)到1 000 mg/L，其次是尸胺，而組胺的產(chǎn)量則明顯低于前兩者，僅有20 mg/L。6 株蜂房哈夫尼菌產(chǎn)生的生物胺中，除H4 菌株產(chǎn)生的腐胺外，其余菌株產(chǎn)生的各種生物胺的量都隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，而逐漸增加。并且，H4 菌株產(chǎn)生腐胺的量明顯低于其它5 株蜂房哈夫尼菌。試驗(yàn)結(jié)果表明，6 株蜂房哈夫尼菌均可分解食品基質(zhì)，產(chǎn)生生物胺，引起食品腐敗變質(zhì)。

圖5 6 株蜂房哈夫尼菌株在貯藏過程中TVB-N 值的變化Fig.5 Changes of TVB-N values of six H.alvei strains during storage

圖6 6 株蜂房哈夫尼菌株在96 h 內(nèi)腐胺含量的變化Fig.6 Changes of putrescine content of six H.alvei strains in 96 h

圖7 6 株蜂房哈夫尼菌株在96 h 內(nèi)尸胺含量的變化Fig.7 Changes of cadaverine content of six H.alvei strains in 96 h

圖8 6 株蜂房哈夫尼菌株在96 h 內(nèi)組胺含量的變化Fig.8 Changes of histamine content of six H.alvei strains in 96 h

3 討論

研究報(bào)道，蜂房哈夫尼菌在致病性方面表現(xiàn)并不明顯[14]，而其主要以腐敗菌形式存在于食品中，本試驗(yàn)對(duì)6 株分離自不同海產(chǎn)品（蝦醬、大菱鲆、即食海參和魚露）的蜂房哈夫尼菌進(jìn)行腐敗相關(guān)特性方面的分析。

許多細(xì)菌能夠產(chǎn)生胞外多糖，包裹細(xì)菌黏附在接觸介質(zhì)表面，隨著空氣或其它接觸物轉(zhuǎn)移，造成細(xì)菌的傳播和污染[15]。食品加工過程中食源性致病菌和腐敗菌能夠在食品加工器械表面形成生物膜，隨著加工過程進(jìn)入食品中，從而引發(fā)食品質(zhì)量與安全問題[16-17]。本文中的蜂房哈夫尼菌能夠形成中等強(qiáng)度以上的生物被膜，對(duì)食品腐敗具有潛在作用。泳動(dòng)性是細(xì)菌依靠鞭毛及周身菌毛的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行的，在生物膜形成過程中扮演著重要角色，有助于細(xì)菌在生物膜形成前期的介質(zhì)表面的附著[18-19]，在由致病菌引起的疾病傳播方面也具有重要作用[2]。文中結(jié)果表明蜂房哈夫尼菌具有泳動(dòng)性，作為常見腐敗菌，在腐敗控制研究方面具有重要意義。Viana 等[20]學(xué)者表明，分離自牛奶中的蜂房哈夫尼菌同樣具有形成較強(qiáng)生物膜的能力，與本文研究結(jié)果相同。6 株蜂房哈夫尼菌的耐鹽性均在0.05 g/mL 以上，能夠在絕大部分食品中正常生長(zhǎng)，并且具有廣譜耐藥性，能夠抵抗多種常見抗生素，因此較易在食品及食品原料中生存，進(jìn)而造成食品的污染。6 株蜂房哈夫尼菌的耐藥性多有差異，可能是因?yàn)樯L(zhǎng)環(huán)境不同，對(duì)細(xì)菌本身產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致菌株耐鹽性和耐藥性的差異[21-22]。

TVB-N 值是反應(yīng)食品腐敗程度的一個(gè)重要指標(biāo)，主要是由于微生物分泌一系列胞外酶，從而引起脫氨、脫羧作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解而形成的產(chǎn)物[23-24]，特別是一磷酸腺苷和脫氨基作用釋放出的氨態(tài)氮是構(gòu)成TVB-N 值的主要物質(zhì)[25]。接種6 株蜂房哈夫尼菌的樣品，其TVB-N 值都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，說明由于蜂房哈夫尼菌的作用，樣品中蛋白質(zhì)發(fā)生降解，進(jìn)而氨基酸被細(xì)菌分解，脫氨基作用加劇，導(dǎo)致TVB-N 值迅速增加，樣品已經(jīng)發(fā)生腐敗，進(jìn)而表明蜂房哈夫尼菌的致腐作用。

生物胺是由生物體內(nèi)的氨基酸降解產(chǎn)生[26]，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，有學(xué)者提出生物胺的形成機(jī)制可能為外源性微生物與內(nèi)源性氨基酸脫羧酶的共同作用所導(dǎo)致[27-28]。試驗(yàn)結(jié)果表明，6 株蜂房哈夫尼菌能夠產(chǎn)生3 種生物胺（腐胺、尸胺和組胺），生物胺的產(chǎn)生可以改善產(chǎn)品的風(fēng)味，提高口感，促進(jìn)人體的正常生理活動(dòng)，然而，過量的生物胺會(huì)導(dǎo)致食品產(chǎn)生難聞氣味，并引起人體的不良生理反應(yīng)[29]。對(duì)食品中生物胺的研究正在逐漸增多，隨著大眾對(duì)食品品質(zhì)的日益重視，研究食品貯藏過程中累積的生物胺，并開發(fā)相關(guān)控制技術(shù)成為食品尤其是海產(chǎn)品貯藏加工領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

本文通過對(duì)6 株分離自海產(chǎn)品的蜂房哈夫尼菌相關(guān)腐敗特性的研究，表明蜂房哈夫尼菌作為食品腐敗菌能夠分解食品基質(zhì)，引起食品腐敗。為以后研究和控制蜂房哈夫尼菌導(dǎo)致的食品腐敗提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。