李 默，曹凱欣，任廣鈺，張鶴男，姜錦惠，閆丹麗，烏日娜

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 沈陽110866）

錦州小菜是遼寧省錦州特色食品之一，是以黃瓜、茄子、辣椒、白菜等新鮮蔬菜經(jīng)醬油、食鹽、食醋、白糖等調(diào)味料腌漬而成[1-2]。傳統(tǒng)錦州小菜由錦州當(dāng)?shù)鼐用癫捎米匀话l(fā)酵方式制作而成，小菜中富含大量發(fā)酵特性良好的天然微生物。孫慧君等[1]通過高通量測序?qū)鹘y(tǒng)發(fā)酵錦州小菜中的微生物多樣性進行分析，結(jié)果顯示：從27 種錦州小菜樣品中共檢測到6 種已知細菌門和53 種細菌屬，從22 種錦州小菜中共檢測到4 種真菌菌門和20 種真菌菌屬。主要的細菌菌屬包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、藍細菌屬（Cyanobacteria_norank）、魏斯氏菌屬（Weissella）、弧菌屬（Vibrio）、葡萄糖桿菌屬（Gluconbacter）等，主要真菌菌屬包括畢赤酵母菌屬（Pichia）、姆拉克酵母菌屬（Mrakia）、鐮刀菌屬（Fusarium）等。這些微生物共同賦予錦州小菜優(yōu)良的口感風(fēng)味和營養(yǎng)價值。

在錦州小菜的發(fā)酵階段，發(fā)揮主要發(fā)酵作用的微生物是乳酸菌和酵母菌，兩者共同作用產(chǎn)生錦州小菜獨特的風(fēng)味成分和營養(yǎng)價值[3-4]。乳酸菌在發(fā)酵過程中主要發(fā)揮產(chǎn)酸作用，降低錦州小菜的pH 值，抑制雜菌生長，同時促進風(fēng)味物質(zhì)的形成[5]。乳酸菌還能產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，如細菌素等，具有抑制雜菌生長的作用[6]，保障小菜品質(zhì)安全。除乳酸菌外，錦州小菜中還富含多種優(yōu)勢酵母菌，酵母菌的生長主要存在于發(fā)酵蔬菜的主發(fā)酵和二次發(fā)酵階段，甚至到碳水化合物被完全耗盡。酵母菌在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生醇類、酯類等風(fēng)味物質(zhì)[7-8]，賦予錦州小菜獨特的醇香和酯香等香氣成分[9]。目前，對錦州小菜中優(yōu)勢菌的研究主要集中在乳酸菌上[10-11]，忽視了能賦予其獨特風(fēng)味的酵母菌。

為從錦州小菜中獲得優(yōu)質(zhì)的酵母菌，本研究以錦州當(dāng)?shù)? 個區(qū)市售的44 種錦州小菜為樣品，對具有優(yōu)良特性的酵母菌進行分離篩選和鑒定，以期為優(yōu)良酵母菌發(fā)酵劑的挖掘提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

1）樣品的采集 用于本研究的試驗樣品采購于遼寧省錦州市的4 個區(qū)（凌河區(qū)、古塔區(qū)、太和區(qū)、松山新區(qū)），共采集44 份錦州小菜樣品。其中凌河區(qū)6 份，古塔區(qū)19 份，太和區(qū)13 份，松山新區(qū)6 份。

2）培養(yǎng)基 孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基[12]、YPD 培養(yǎng)基[13]、麥芽汁培養(yǎng)基[14]、TTC 上層培養(yǎng)基[15]均為實驗室配制。

1.1.2 試驗試劑 TaqTM 聚合酶，大連TaKaRa公司；PCR 引物，上海派森諾生物科技有限公司；瓊脂糖，生工生物工程（上海）股份有限公司；氯霉素、甲醛、硫酸銅、百里酚藍、冰醋酸等均為國產(chǎn)分析純級試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10 pH 計，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；FA1004 分析天平，上海精科天平廠；DNP-9272 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Mini Pro 300V 電泳儀，上海力申科學(xué)儀器有限公司；ABI3730XL 測序儀，美國Applied Biosystems 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的分離 準(zhǔn)確稱取各樣品25 g，與225 g 無菌生理鹽水混合，充分振蕩后進行梯度稀釋，分別取200 μL 各樣品稀釋液，涂布于孟加拉紅和YPD 固體平板，28 ℃培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài)，挑取酵母菌相似單菌落，在孟加拉紅固體培養(yǎng)基進行純化，并將單菌落用亞甲基藍染色后，顯微鏡鏡檢觀察，將顯微鏡下相似酵母菌形態(tài)的菌株進行保藏并編號。

1.3.2 耐酸、耐膽鹽特性 優(yōu)良酵母菌應(yīng)能夠在人體腸道極端環(huán)境下存活，本研究檢測了酵母菌菌株在酸（pH 3.0）和膽鹽（0.3 g/100 mL）環(huán)境中存活情況，挑取保藏好的酵母菌菌株，接種于YPD液體培養(yǎng)基活化3 代，取第3 代活化菌株，做耐酸、耐膽鹽試驗。

1）耐酸特性 分別取100 μL 各活化菌液，接種于10 mL pH 值為3.0 的無菌YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下，分別培養(yǎng)0，1，2，3 h，利用傾注法對不同時間下的菌懸液進行活菌計數(shù)，每個樣品做3 次平行試驗。

2）耐膽鹽特性 分別取100 μL 各活化菌液，接種于10 mL 含3 g/L 牛膽鹽的無菌YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)0，2，4，6 h，利用傾注法對不同時間下的菌懸液進行活菌計數(shù)，每個樣品做3 次平行試驗。

1.3.3 酵母菌發(fā)酵特性初篩 挑取保藏好的酵母菌菌株接種于YPD 液體培養(yǎng)基活化3 代，取第3代活化菌液，并調(diào)節(jié)菌數(shù)到107CFU/mL 用于酵母菌的發(fā)酵特性分析試驗。

1）耐鹽特性 分別取100 μL 各活化菌液接種于10 mL 含0，50，80，100，120，150 g/L NaCl 的無菌YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，測定菌懸液在波長600 nm 處的OD 值，每個樣品做3 次平行試驗。

2）產(chǎn)氣試驗 采用杜氏小管發(fā)酵法，將裝滿YPD 培養(yǎng)基的杜氏小管倒置于裝有10 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中，121 ℃滅菌20 min，取滅菌后杜氏小管內(nèi)無氣泡的試管備用。將100 μL 各活化菌液接種于裝有杜氏小管的YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察杜氏小管中有無氣泡產(chǎn)生及氣泡體積，記錄菌株的產(chǎn)氣情況。

3）產(chǎn)璞試驗 分別取100 μL 各活化菌液，接種于10 mL 滅菌麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察各菌株對應(yīng)試管表面是否產(chǎn)璞，并記錄產(chǎn)璞情況。

4）產(chǎn)醇試驗 參照張春芝等[16]方法測定酵母菌的產(chǎn)醇能力。

1.3.4 酵母菌的復(fù)篩 取100 μL 調(diào)整好菌數(shù)的酵母菌菌液，接種于滅菌好的白菜汁中進行發(fā)酵，在28 ℃下培養(yǎng)48 h，每個菌株做3 個平行試驗，取不接酵母菌的白菜汁作為空白對照，發(fā)酵好的菌液保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

參照劉春燕[17]描述的方法，測定酵母菌利用還原糖的能力、產(chǎn)氨基態(tài)氮能力；參照張鵬[18]描述的方法測定酵母菌產(chǎn)總酯能力。

1.3.5 酵母菌的鑒定

1）形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化試驗鑒定 觀察單菌落的形態(tài)特征，挑取單個酵母菌菌落用亞甲基藍染色后顯微鏡鏡檢觀察。

參照《真菌鑒定手冊》[19]和《酵母菌的特征與鑒定手冊》[20]對復(fù)篩得到的優(yōu)質(zhì)酵母菌進行糖發(fā)酵、氮源同化等生理生化試驗，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化試驗分析，對菌株進行初步鑒定。

2）26S rDNA 鑒定 將復(fù)篩得到的菌株進行活化，按照試劑盒的操作流程提取酵母菌菌株的 總DNA，以ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3’，ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 為擴增引物對菌株DNA 進行PCR 擴增，PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗[21-22]，PCR 擴增產(chǎn)物送上海派森諾公司進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離

從44 種錦州小菜中共分離得到菌株87 株，經(jīng)菌落形態(tài)觀察及亞甲基藍顏色后，用顯微鏡形態(tài)觀察，初步鑒定酵母菌的疑似菌株20 株，分別將 其進行編號（JC1、HC1、HC2、LB1、HG1、HG2、HD1、HD2、HD3、QZ1、QZ2、LJ1、LJ2、LJ3、LJ4、SJ1、SJ2、SJ3、SJ4 和SJ5）。

2.2 酵母菌的耐酸、耐膽鹽能力比較

2.2.1 耐酸能力 通過比較20 株酵母菌菌株的耐酸能力，檢測不同菌株在pH 3 條件下的生長狀況，結(jié)果見表1。隨著培養(yǎng)時間的延長，酵母菌的活菌數(shù)出現(xiàn)減少的趨勢，其中部分菌株在pH 3條件下培養(yǎng)3 h 后，存活率仍能達到80%以上，說明 這些菌株（HG2、HD1、HD3、LJ1、SJ4、SJ5）具 有較好的耐酸能力。

表1 酵母菌的耐酸能力Table 1 The acid tolerance of yeast

2.2.2 耐膽鹽能力 將酵母菌接種于膽鹽質(zhì)量濃度為3 g/L 的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)0，2，4，6 h，檢測酵母菌的存活狀況，比較20 株酵母菌的耐膽鹽能力，結(jié)果如表2所示。隨著培養(yǎng)時間的延長，酵母菌的活菌數(shù)出現(xiàn)減少的趨勢，其中部分菌株在膽鹽質(zhì)量濃度為3 g/L 條件下培養(yǎng)6 h 后，存活率仍能達到80%以上，說明這些菌株（HC1、LB1、HG2、HD3、LJ1、SJ3、SJ4、SJ5）具有較好的耐膽鹽能力。

表2 酵母菌的耐膽鹽能力Table 2 The bile salt tolerance of yeast

2.3 酵母菌的初篩

為得到適合作為蔬菜發(fā)酵劑的優(yōu)良酵母菌菌株，選擇耐鹽、產(chǎn)氣、產(chǎn)璞、產(chǎn)醇等指標(biāo)作為酵母菌的初步篩選指標(biāo)，將分離的20 株酵母菌利用以下指標(biāo)進行初篩，選擇合適的酵母菌菌株進行下一步試驗。

2.3.1 耐鹽能力 通過檢測酵母菌在不同NaCl質(zhì)量濃度（0，50，80，100，120，150 g/L）下的生長狀況，比較20 株酵母菌的耐鹽能力，結(jié)果如表3所示。由表可見，大部分菌株可以耐受50 g/L NaCl質(zhì)量濃度，然而隨著NaCl 質(zhì)量濃度的升高，所有菌株的生長都逐漸變得緩慢，在150 g/L NaCl 條件下，幾乎所有菌株都停止生長，在120 g/L NaCl條件下，部分菌株（HC1、HG2、HD3、LJ1、SJ1、SJ4、SJ5）的OD 值在0.6 以上，說明這些菌株仍可以緩慢生長，具有較強的耐鹽能力。

表3 酵母菌在不同NaCl 質(zhì)量濃度下生長的OD600nm 值Table 3 The OD600nm value of yeast in different NaCl mass concentrations

（續(xù)表3）

2.3.2 產(chǎn)氣、產(chǎn)璞能力 酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生氣體會破壞發(fā)酵蔬菜的質(zhì)地，從而影響發(fā)酵產(chǎn)品的口感。一些酵母菌在發(fā)酵過程中還存在產(chǎn)璞現(xiàn)象，產(chǎn)璞會導(dǎo)致發(fā)酵制品表面存在一層白膜，不僅會影響產(chǎn)品的外觀，而且會使發(fā)酵制品產(chǎn)生不良氣味，嚴重影響發(fā)酵產(chǎn)品的銷售。優(yōu)良酵母菌應(yīng)具備不產(chǎn)氣、不產(chǎn)璞的特性，本研究檢測了20 株酵母菌的產(chǎn)氣、產(chǎn)璞情況，結(jié)果見表4。由表4可見，部分菌株（HC2、HG2、HD3、LJ1、LJ2、SJ1、SJ4、SJ5）表現(xiàn)出既不產(chǎn)氣也不產(chǎn)璞的特性。

表4 酵母菌的產(chǎn)氣、產(chǎn)璞能力Table 4 Gas production capacity and calving capacity of yeast

2.3.3 產(chǎn)醇能力 酵母菌能利用發(fā)酵基質(zhì)中的糖分，將其轉(zhuǎn)化成乙醇，賦予發(fā)酵制品特殊的醇香風(fēng)味[23]，同時，乙醇還可以與其它有機酸、醛類等風(fēng)味物質(zhì)相互轉(zhuǎn)換，并生成乙酸乙酯等重要的風(fēng)味物質(zhì)[24-25]。優(yōu)良酵母菌發(fā)酵劑應(yīng)具有產(chǎn)醇特性，本研究檢測了20 株酵母菌的產(chǎn)醇能力，檢測結(jié)果如表5所示，大部分菌株都具有產(chǎn)醇能力，然而強弱有所不同，其中部分菌株（HC1、HC2、HG2、HD3、LJ1、LJ3、LJ4、SJ2、SJ4、SJ5）具有較強的產(chǎn)醇能力。

經(jīng)過耐酸、耐膽鹽能力的比較，及耐鹽、產(chǎn)氣、產(chǎn)璞和產(chǎn)醇等發(fā)酵特性的比較，發(fā)現(xiàn)菌株HG2、HD3、LJ1、SJ4 和SJ5 具有較好的耐酸耐膽鹽能力，同時具有較好的耐鹽、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)璞和產(chǎn)醇等發(fā)酵特性，因此選擇這5 株酵母菌進行下一步試驗。

表5 酵母菌的產(chǎn)醇能力Table 5 Alcohol production ability of yeast

2.4 優(yōu)良酵母菌的復(fù)篩

優(yōu)質(zhì)的酵母菌應(yīng)具有較好的利用糖能力，產(chǎn)風(fēng)味能力，分解蛋白能力，才能確保其在發(fā)酵過程中較好的發(fā)揮發(fā)酵作用，因此，通過比較酵母菌在發(fā)酵前、后的還原糖消耗情況，酯類物質(zhì)（以乙酸乙酯計）的生成情況，以及氨基酸肽氮的生成情況等指標(biāo)，對優(yōu)良酵母菌進行進一步的篩選。

2.4.1 不同酵母菌利用糖的能力 酵母菌在發(fā)酵過程中對糖的利用能力是評價酵母菌發(fā)酵性能的重要指標(biāo)之一，其對糖的利用能力越強，說明其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)越多。此外，酵母菌對發(fā)酵基質(zhì)中糖分的利用，也可以抑制發(fā)酵制品中其它雜菌的生長繁殖，本研究比較了初篩得到的5 株酵母菌對白菜汁中還原糖的利用情況，結(jié)果如圖1所示。菌株HD3 表現(xiàn)出了最高還原糖消耗率，為1.46%，其次是SJ4 菌株，也表現(xiàn)出較高的還原糖消耗率，為1.21%，說明這2 株菌具有相對較強的利用發(fā)酵基質(zhì)中糖的能力。

2.4.2 不同酵母菌的產(chǎn)風(fēng)味能力 酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)大多是以酯類形式存在，本研究以乙酸乙酯的產(chǎn)生量為指標(biāo)，比較不同酵母菌的產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力，結(jié)果如圖2所示，其中菌株SJ4 表現(xiàn)出產(chǎn)總酯的增加量最高，為4.62 g/100 mL，其次是菌株HD3，其總酯增加量相對較高，為4.01 g/100 mL。

2.4.3 不同酵母菌的分解蛋白能力 酵母菌在發(fā)酵過程中能夠分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生肽和氨基酸等小分子物質(zhì)，氨基酸能改善發(fā)酵制品的風(fēng)味，提高其營養(yǎng)價值，本研究通過檢測不同酵母菌發(fā)酵后白菜汁中氨基酸態(tài)氮含量來評估發(fā)酵液中氨基酸含量，進一步比較不同酵母菌對蛋白質(zhì)的分解能力，結(jié)果如圖3所示，菌株HD3 和菌株SJ4 的發(fā)酵液中都檢測到較高含量的氨基酸態(tài)氮，分別為0.072 g/100 mL 和0.068 g/100 mL。

圖1 不同酵母菌菌株消耗還原糖能力Fig.1 The ability of different yeast strains to consume reducing sugar

圖2 不同酵母菌產(chǎn)酯增加量Fig.2 Increase in ester production by different yeasts

圖3 不同酵母菌發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮的含量Fig.3 Amino acid nitrogen content in different yeast fermentation broth

通過酵母菌發(fā)酵特性復(fù)篩試驗，綜合以上指標(biāo)，得出HD3 和SJ4 具有較好的利用糖能力、產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力和分解蛋白能力，因此，對酵母菌HD3 和SJ4 進行形態(tài)學(xué)、生理生化試驗及26S rDNA 鑒定。

2.5 酵母菌的鑒定

2.5.1 形態(tài)學(xué)觀察 酵母菌經(jīng)純化后，進一步對其菌落形態(tài)及個體形態(tài)進行觀察，觀察結(jié)果如表6和圖4所示。

表6 形態(tài)學(xué)觀察Table 6 Morphological observation

圖4 菌株HD3、SJ4 的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)圖Fig.4 Colony morphology and cell morphology of strains HD3 and SJ4

2.5.2 生理生化試驗 取純化后的HD3 和SJ4菌株進行生理生化試驗，結(jié)果如表7所示，從生理生化試驗結(jié)果可以看出，2 株酵母菌表現(xiàn)出不同的特征，參照《酵母菌的特征及鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》，并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，初步鑒定HD3 為畢赤酵母菌屬，SJ4 為孢圓酵母屬。

表7 生理生化試驗分析Table 7 Analysis of physiological and biochemical tests

2.5.3 26 S rDNA 鑒定結(jié)果

1）26S rDNA 擴增結(jié)果 以提取出的酵母菌基因組DNA 為模板進行PCR 擴增，擴增后的PCR 產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結(jié)果表明，這2 株酵母菌菌株的PCR 產(chǎn)物在600 bp 左右均有明顯的亮帶，說明PCR 擴增成功，可以送出測序。部分代表性酵母菌菌株的PCR 產(chǎn)物檢測結(jié)果如圖5所示。

圖5 酵母菌PCR 產(chǎn)物檢測電泳圖Fig.5 Yeast PCR product detection electropherogram

2）酵母菌26S rDNA D1/D2 區(qū)序列同源性比對 將酵母菌HD3 和SJ4 的26S rDNA D1/D2的擴增產(chǎn)物序列結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），比對結(jié)果如表8所示。

由表8可見，菌株HD3 與畢赤酵母菌（Pichia fermentants）的同源性達到100%，菌株SJ4 與戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）的同源性達到99%。

綜上所述，經(jīng)形態(tài)學(xué)分析、生理生化試驗鑒定，并結(jié)合26S rDNA 鑒定，菌株HD3 鑒定為畢赤酵母菌（Pichia fermentants），菌株SJ4 鑒定為戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）。

表8 酵母菌26S rDNA D1/D2 區(qū)序列同源性對比結(jié)果Table 8 Comparison of sequence homology of yeast 26S rDNA D1/D2 region

3 結(jié)論

發(fā)酵制品中主要風(fēng)味物質(zhì)來源除自身風(fēng)味成分之外，其余風(fēng)味成分主要來源于微生物分解的代謝產(chǎn)物，包括酵母菌發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)生的有機酸、醇類、酯類、氨基酸類等物質(zhì)[26-27]，這些物質(zhì)的產(chǎn)生對改善發(fā)酵制品的風(fēng)味至關(guān)重要[28]。本研究從44 種遼寧特色錦州小菜中篩選獲得的酵母菌菌株HD3和SJ4 表現(xiàn)出良好的發(fā)酵特性，同時具有較高的還原糖消耗率、產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力和分解蛋白質(zhì)能力，可作為酵母菌發(fā)酵劑應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，具有進一步研究的價值。