楊維宇，張 艷，李芬芬，黃丹菲*

（1 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047 2 江西省吉安市第一人民醫(yī)院 江西吉安343000）

一些疏水性活性物質(zhì)所具有的各種藥理作用已被廣泛認(rèn)可，然而其溶解性及穩(wěn)定性較低，限制了其在體內(nèi)的生物利用率及實(shí)際應(yīng)用[1]。為此，研究出簡(jiǎn)單易得又對(duì)生物體無(wú)毒害作用的疏水性活性物質(zhì)的載體，成為食品行業(yè)亟待解決的關(guān)鍵性問(wèn)題。近年來(lái)，眾多研究表明，將疏水性活性物質(zhì)包埋或接枝于兩親性聚合物中，可有效增加其溶解性，從而提高其生物利用率。天然活性多糖因具有特殊的結(jié)構(gòu)，極好的功能特性，獲得方法簡(jiǎn)單，易被降解等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，成為主要關(guān)注對(duì)象[2]。如將天然多糖進(jìn)行疏水化修飾，利用其分子間和分子內(nèi)疏水基團(tuán)的相互作用，形成核殼結(jié)構(gòu)的自聚集膠束。疏水藥物或者其它生物活性物質(zhì)包裹在內(nèi)核中，親水多糖鏈外殼不僅能提升其溶解性，增加膠束的穩(wěn)定性，還能適當(dāng)延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)，增加其吸收利用率。有學(xué)者提出，兩親性聚合物進(jìn)入體內(nèi)后，可能會(huì)與其生命系統(tǒng)呈現(xiàn)出更優(yōu)的兼容性，與機(jī)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)元素或者各種酶類物質(zhì)產(chǎn)生更好的相互作用，提升機(jī)體對(duì)物質(zhì)的利用[3]。兩親性多糖可在較低濃度下形成膠束結(jié)構(gòu)，包載疏水性物質(zhì)通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)運(yùn)輸方式，至病變部位，降低藥物對(duì)正常組織的毒副作用[4]。葡聚糖作為非離子型多糖的一種，不僅溶于水，還能夠溶于二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）等有機(jī)溶劑中，使其在合成兩親性葡聚糖衍生物時(shí)更容易選擇與葡聚糖和疏水分子相容的溶劑。與此同時(shí)，所合成的疏水化合物可以成為某些疏水性藥物或活性物質(zhì)的貯藏庫(kù)，防止藥物等過(guò)早降解和消除[5]，有效提升這些疏水性活性物質(zhì)的利用率，使其更好地發(fā)揮本身的多項(xiàng)功能。

本文利用硬脂酸對(duì)燕麥β-葡聚糖進(jìn)行疏水化改性，得到兩親性燕麥β-葡聚糖，即燕麥β-葡聚糖硬脂酸酯（Oat β-glucan stearate ester，OGE），探究OGE 的基本特性，為其作為疏水性藥物或生物活性物質(zhì)的載體提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

燕麥β-葡聚糖（80%），張家口一康生物科技有限公司；硬脂酸（分析純），上海國(guó)藥集團(tuán)；N，N’-羰基二咪唑（99%），阿拉丁試劑有限公司；異丙醇（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、無(wú)水甲醇（分析純），西隴科學(xué)股份有限公司；二甲基亞砜（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；氘代二甲基亞砜（Methyl sulfoxide-d6，DMSO-d6，99.9%）、二甲基亞砜（色譜純）、正庚烷（色譜級(jí)）、溴化鉀（光譜純）、甲醇鈉（分析純）、硬脂酸甲酯（≥99%），阿拉丁試劑有限公司；熒光探針芘（≥99%，色譜純），美國(guó)Sigma-Aldrich 試劑公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Fatal bovine serun，F(xiàn)BS），索萊寶生物科技有限公司；Cell counting kit-8 （CCK-8 試劑盒），日本同仁化學(xué)研究所。

6890N 型氣相色譜儀 （配有FID 檢測(cè)器和Rev.A.10.02 色譜工作站），美國(guó)Agilent Technologies 公司；ALPHA 1-2 冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Martin Christ 公司；Nicolet FT-IR 5700 型傅立葉紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Electron 公司；AL 104 電子天平，上海梅特勒-托利多儀器公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；恒溫磁力加熱攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；TDL-5 型離心沉淀機(jī)，上海飛鴿系列離心機(jī)廠；QL-861 渦旋振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Milli-Q Academic 超純水系統(tǒng)，Millipore 公司；Bruker AV 600 MHz 核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀，日本電子電器公司；生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；粒度和電位測(cè)量?jī)x，英國(guó)馬爾文儀器有限公司等；F-700 熒光分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 燕麥β-葡聚糖硬脂酸酯（OGE）的制備參照祝佩佩等[6]的方法，并稍做修改。稱取不同摩爾質(zhì)量的硬脂酸于25 mL DMSO 后，置于70℃恒溫水浴中至完全溶解，加入等量N，N’-羰基二咪唑混勻，70 ℃條件下反應(yīng)15 h 后，獲得硬脂酸?；溥蚧罨骸７Q取1 g 燕麥β-葡聚糖，完全溶解于20 mL DMSO 中，分別加入不同體積、不同濃度的硬脂酸酰基咪唑活化液，70 ℃、300 r/min反應(yīng)不同時(shí)間。待反應(yīng)液完全冷卻后，加入2 倍體積的異丙醇醇沉10 h，抽濾獲得沉淀物質(zhì)。將獲得的沉淀物質(zhì)完全溶解于80 mL 超純水中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾除去有機(jī)成分，將產(chǎn)物置于透析袋中，依次用自來(lái)水、蒸餾水和超純水各透析24 h，冷凍干燥后備用。

1.2.2 OGE 取代度的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 本試驗(yàn)采用的脂肪酸甲酯的氣相色譜條件參考楊瀅等[7]建立并驗(yàn)證的方法。準(zhǔn)確稱取一定量的硬脂酸甲酯標(biāo)品溶解于正庚烷中，分別配制成質(zhì)量濃度為3.20，1.60，0.80，0.40，0.20，0.10，0.05 mg/mL 的樣液，利用氣相色譜儀進(jìn)樣測(cè)定。記錄出峰時(shí)間和峰面積，以出峰面積為縱坐標(biāo)，硬脂酸甲酯的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制硬脂酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

色譜條件：CP-Sil88 型毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm×0.39 mm，0.20 μm，Varian Inc，USA），F(xiàn)ID 檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度250 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃。

1.2.2.2 樣品的取代度測(cè)定 取代度測(cè)定參照陳芳[9]的研究方法，稱取一定量的OGE 于具塞試管中，加入0.50 mL DMSO 后使其完全溶解，加入1 mL 4 mg/mL 現(xiàn)配的甲醇鈉甲醇溶液，置于80 ℃恒溫水浴鍋中密閉加熱1 h，取出反應(yīng)液。待反應(yīng)液完全冷卻后加入1 mL 正庚烷和1 mL 飽和氯化鈉溶液，靜置分層。取上層清液過(guò)0.22 μm 膜，利用氣相色譜儀測(cè)定樣品中硬脂酸甲酯的含量，進(jìn)而計(jì)算出樣品的取代度。取代度（DS）按公式（1）計(jì)算。

式中，A——酰基含量 （%）；M——?；姆肿淤|(zhì)量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 硬脂酸?；溥蚧罨禾砑恿繉?duì)取代度的影響 在硬脂酸活化液的添加量分別為2.50，3.50，4.50，5.50，6.50 mL 時(shí)，固定條件：反應(yīng)溫度70 ℃，反應(yīng)時(shí)間4.0 h。

1.2.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)取代度的影響 在反應(yīng)溫度分別為70，80，90，100 ℃時(shí)，固定條件：硬脂酸活化液添加量4.50 mL，反應(yīng)時(shí)間4 h。

1.2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)取代度的影響 在反應(yīng)時(shí)間分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 h 時(shí)，固定條件：硬脂酸活化液添加量4.50 mL，反應(yīng)溫度70 ℃。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用3 因素3 水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以取代度的高低為基準(zhǔn)探究OGE 的最佳制備條件。前期單因素試驗(yàn)結(jié)果作為參考，硬脂酸活化液添加量（A）選取4.50，5.50，6.50 mL；反應(yīng)溫度（B）選擇70，80，90 ℃；反應(yīng)時(shí)間（C）選擇4.0，4.5，5.0 h，探討正交設(shè)計(jì)下各試驗(yàn)取代度的值，確定OGE 的最佳制備條件。

1.2.5 OGE 的物理特性表征

1.2.5.1 掃描電鏡外觀形態(tài)分析 取少量?jī)龈蓸悠酚跇悠放_(tái)上，置于離子濺射儀中鍍一層導(dǎo)電金膜，利用掃描電鏡觀察OGE 的外觀形態(tài)，與燕麥β-葡聚糖的電鏡圖對(duì)比，在合適倍數(shù)下拍照記錄[10]。

1.2.5.2 粒徑大小分析 稱取不同取代度的OGE 1.80 mg 于3 mL 超純水中，加熱至沸使其完全溶解，冷卻至室溫并補(bǔ)齊溶液至3 mL，室溫下攪拌36 h，得到OGE 的自聚集溶液。將制備好的自聚集溶液在5 600×g 下離心10 min，取上層加入比色杯中，大約裝至比色杯的1/3 處，置于粒度儀中測(cè)定其粒徑大小及PDI 值。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次[11]，并記錄其平均值。

1.2.5.3 傅里葉紅外光譜圖分析 稱取少量的樣品于真空干燥機(jī)中干燥24 h。將干燥好的樣品與光譜級(jí)溴化鉀以1∶100 的比例混合，充分研磨，利用壓片法測(cè)其紅外光譜圖[12]。同時(shí)測(cè)定未經(jīng)改性的燕麥β-葡聚糖的紅外光譜圖，進(jìn)行對(duì)比，得出新出現(xiàn)的峰，并分析其所對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)。

1.2.5.4 氫核磁共振譜圖分析 將少量樣品完全溶解于0.60 mL 的DMSO-d6 中，通過(guò)一維氫譜圖表征，與原燕麥β-葡聚糖的氫譜圖進(jìn)行對(duì)比，分析出由于改性而產(chǎn)生的化學(xué)位移，從而確定是否改性成功。

1.2.6 OGE 的臨界聚集濃度（Critical aggregation concentration，CAC） 臨界聚集濃度的測(cè)定利用熒光探針?lè)?，方法參照文獻(xiàn)[13]并稍作修改。準(zhǔn)備稱取芘標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度為3×10-4mol/L 的芘甲醇溶液。取10 mL 的具塞試管，每管中加入3×10-4mol/L 的芘甲醇溶液20 μL 后，用氮?dú)鈱⑷芤褐械募状即蹈伞＿x取不同取代度的OGE，再向每管中加入10 mL 不同取代度、不同濃度（0.0002～3 mg/mL） 的OGE 溶液，此時(shí)芘的最終濃度為6×10-7mol/L，室溫下避光高速攪拌5 h 后，利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定芘的發(fā)射光譜。測(cè)定條件：激發(fā)波長(zhǎng)330 nm，發(fā)射和激發(fā)狹縫均為5 nm，發(fā)射光譜的掃描范圍350～500 nm。記錄I1（374 nm） 和I3（385 nm）處的熒光強(qiáng)度。以O(shè)GE 濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，I1/I3的值為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，并進(jìn)行曲線擬合后，求兩擬合曲線交點(diǎn)處的橫坐標(biāo)，換算成濃度，此時(shí)的濃度即臨界聚集濃度。

1.2.7 OGE 的溶解度 稱取一定取代度的OGE，配制成2.0 mg/mL 的溶液，將溶液于100 ℃下加熱15 min 后取出，離心20 min（3 000×g），收集上清液烘干稱重，并記錄，按式（2）計(jì)算其溶解度。

1.2.8 OGE 的細(xì)胞毒性分析 從液氮罐中取出裝有Raw264.7 細(xì)胞的凍存管1 支，37 ℃水浴復(fù)蘇、傳代、定期換液等工作。試驗(yàn)開(kāi)始前加入新鮮DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10%FBS）制成細(xì)胞懸液，1 000×g 離心5 min 后，棄上清后，加入新鮮培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞濃度調(diào)成3×104個(gè)/孔的密度，以100 μL/孔接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，使細(xì)胞充分貼壁，棄上清后，以100 μL/孔加入不同濃度（25，50，100，200 μg/mL）的OGE 溶液至各孔中，每組設(shè)置6 個(gè)重復(fù)孔[14-15]。在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加入10 μL CCK-8 液，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h 左右，在波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)定吸光值（OD 值）[16]。

式中，A1——試驗(yàn)孔吸光值 （OD 值）；A2——對(duì)照空吸光值（OD 值）；A0——空白孔吸光值（OD值）。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 本試驗(yàn)各數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。利用MestReNova 軟件進(jìn)行NMR 圖譜數(shù)據(jù)處理，SPSS Statistics 24 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析，采用單因素方差分析進(jìn)行各組間指標(biāo)差異比較，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥β-葡聚糖硬脂酸酯（OGE）的制備

2.1.1 硬脂酸活化液添加量對(duì)取代度的影響 有報(bào)道稱，脂肪酸酯化多糖的反應(yīng)是可逆的[17]。因此，硬脂酸?；溥虻脑黾哟偈乖擋セ磻?yīng)向正方向不斷進(jìn)行。從圖1可以清晰地看出，隨著硬脂酸?；溥蛱砑恿坎粩嘣黾?，產(chǎn)物取代度也不斷增加。推測(cè)由于隨著硬脂酸?；溥蛱砑恿康脑黾?，燕麥β-葡聚糖與?；溥蛑g的碰撞頻率也隨之不斷增大，使得整個(gè)體系中的酯化效率相應(yīng)提高[18]。繼續(xù)添加硬脂酸?；溥驎r(shí)，硬脂酸?；溥蚺c燕麥β-葡聚糖中的羥基基團(tuán)發(fā)生的反應(yīng)也慢慢趨于飽和，反應(yīng)速率減緩，取代度的增加趨勢(shì)也變得較為緩慢。

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)取代度的影響 圖2是酯化反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物取代度的變化圖，其中，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度從70 ℃升至80 ℃時(shí)，酯化產(chǎn)物的取代度從0.036 增加至0.057 后，繼續(xù)升高體系的反應(yīng)溫度，對(duì)酯化反應(yīng)的影響不是很大，取代度數(shù)值變化較小，并趨于平緩?？赡苡捎跍囟壬撸蠓肿渔湹幕钚砸蚕鄳?yīng)增強(qiáng)，促使反應(yīng)體系中分子間的有效碰撞次數(shù)增加，取代度隨之發(fā)生變化[19]。當(dāng)反應(yīng)體系中參與反應(yīng)的分子達(dá)到飽和時(shí)，有效碰撞的次數(shù)不再增加，取代度的變化也趨于穩(wěn)定。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)取代度的影響 根據(jù)酯化反應(yīng)的理論分析結(jié)果，酯化反應(yīng)會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸達(dá)到一個(gè)極限值[20]。如圖3所示，隨著酯化反應(yīng)時(shí)間的持續(xù)延長(zhǎng)，取代度相應(yīng)升高，燕麥β-葡聚糖的酯化反應(yīng)也越充分。酯化反應(yīng)在4.5 h 前，由于體系中生成的OGE 濃度較低，使得體系中的酯化反應(yīng)能夠持續(xù)進(jìn)行。而當(dāng)整個(gè)體系在反應(yīng)進(jìn)行到5.0 h 時(shí)，產(chǎn)物的取代度增長(zhǎng)幅度變得緩慢，此時(shí)反應(yīng)體系中的酯化反應(yīng)與分解反應(yīng)即將平衡。因此，反應(yīng)時(shí)間并不能無(wú)限延長(zhǎng)下去。

2.1.4 OGE 制備條件的優(yōu)化 利用SPSS Statistics 24 軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用3 因素3 水平進(jìn)一步研究硬脂酸活化液添加量（A）、反應(yīng)溫度（B）和反應(yīng)時(shí)間（C）對(duì)OGE 取代度的影響，確定出OGE 的最佳制備條件。

從表1中可以清楚的得到此反應(yīng)中OGE 的最佳制備條件，即當(dāng)硬脂酸?；溥蛱砑恿繛?.50 mL，反應(yīng)溫度為90 ℃，反應(yīng)時(shí)間為5.0 h 時(shí)，有最大取代度，為0.133。

2.2 OGE 的外觀形態(tài)及粒徑

圖1 酸活化液添加量與取代度的關(guān)系Fig.1 The relationship between the amount of acid activator and degree of substitution

圖2 反應(yīng)溫度與取代度的關(guān)系Fig.2 The relationship between reaction temperature and degree of substitution

圖3 反應(yīng)時(shí)間與取代度的關(guān)系Fig.3 The relationship between reaction time and the degree of substitution

分別配制1 mg/mL 的燕麥多糖溶液和同質(zhì)量濃度的OGE 溶液作對(duì)比可以看出，OGE 溶液更為渾濁，且上層有很多泡沫存在，而燕麥多糖溶液則清澈，且?guī)缀鯚o(wú)泡沫存在。推測(cè)是由于在原燕麥β-葡聚糖中接入了硬脂酸，硬脂酸本身具備乳化、穩(wěn)定及潤(rùn)滑作用有可能也帶入到OGE 中，使得OGE 液體上方出現(xiàn)諸多泡沫。

表1 燕麥β-葡聚糖硬脂酸酯制備條件正交結(jié)果Table 1 Orthogonal results of preparation conditions of oat beta-glucan stearate

據(jù)相關(guān)報(bào)道，兩親性多糖在較低濃度下能夠形成殼核結(jié)構(gòu)的自聚集膠束，納米膠束的外觀形態(tài)大多呈球狀[21]。如圖5所示，OGE 在掃描電鏡下可以清晰地看出其外觀形態(tài)為球形，較原燕麥β-葡聚糖的粒徑更小，大小更為均一。原燕麥β-葡聚糖有干癟狀的球形，而經(jīng)過(guò)改性后的兩親性多糖更加飽滿。

大多數(shù)兩親性多糖形成的膠束的PDI 都非常窄。PDI 值越小表示粒徑分布越窄，顆粒大小越均一[22]。有研究表明，當(dāng)PDI＞0.7 時(shí)，代表顆粒的粒徑分布較寬[23]。正如表2所示，OGE 的PDI＜0.7，可認(rèn)為OGE 的粒徑大小較為均一，與掃描電鏡呈現(xiàn)的表觀形態(tài)一致。然而在不同取代度下，OGE 的粒徑大小也存在差異，隨取代度的增加，OGE 的粒徑大小反而降低?？赡苡捎贠GE 本身形成的膠束體系中，不同取代度下的比表面積和表面能的差異，導(dǎo)致自發(fā)的粒子聚集程度不同所致[24]。疏水改性后的多糖相比較原糖來(lái)說(shuō)，即取代度為0 時(shí)，粒徑更小，其PDI 值也越小。

2.3 傅里葉變換紅外光譜圖

從圖6可以清晰地看到，經(jīng)過(guò)硬脂酸疏水改性后的燕麥β-葡聚糖與原燕麥β-葡聚糖的紅外光譜圖最大的區(qū)別在于1 738.3 cm-1處出現(xiàn)了新的峰。1 738.3 cm-1處新出現(xiàn)的峰是由于酯羰基振動(dòng)產(chǎn)生，且從圖中可以看出，峰的強(qiáng)度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變強(qiáng)，即隨著取代度的增加峰強(qiáng)度增加，可以證明經(jīng)過(guò)硬脂酸疏水改性后的燕麥β-葡聚糖引入了酯羰基，從而驗(yàn)證燕麥β-葡聚糖與硬脂酸之間確實(shí)發(fā)生了酯化反應(yīng)[9，25]。

圖4 燕麥β-葡聚糖溶液與OGE 溶液（質(zhì)量濃度均為1 mg/mL）Fig.4 Oat β-glucan solution and OGE solution （1 mg/mL）

圖5 掃描電鏡下的燕麥β-葡聚糖和OGE 外觀形態(tài)Fig.5 The appearance of oat β-glucan and OGE under scanning electron microscope

表2 取代度與膠束粒徑大小Table 2 Substitution degree and micelle size

圖6 不同取代度的燕麥β-葡聚糖酯與燕麥β-葡聚糖的紅外光譜Fig.6 The infrared spectra of oat β-glucan ester with degree of substitution and oat β-glucan

2.4 氫核磁共振譜圖

從圖7可知，經(jīng)過(guò)硬脂酸疏水改性后的燕麥β-葡聚糖與原燕麥β-葡聚糖的氫核磁圖譜對(duì)比發(fā)現(xiàn)，燕麥β-葡聚糖酯的氫核磁圖譜中出現(xiàn)4 個(gè)新峰。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，2.50 ppm 處為DMSO-d6的質(zhì)子峰，3.31 ppm 處為水的質(zhì)子峰[9，26]。其中，0.86 ppm 處的峰對(duì)應(yīng)的是OGE 分子酰基鏈上的末端甲基的3 個(gè)氫[25]；1.24 ppm 處對(duì)應(yīng)于與終端甲基相連的4 個(gè)亞甲基的質(zhì)子；2.33 ppm 處的峰對(duì)應(yīng)?；溕吓c羰基相連的亞甲基質(zhì)子；1.40 ppm處出現(xiàn)的峰為緊隨其后的亞甲基的質(zhì)子[27]。由此可以得出，經(jīng)過(guò)硬脂酸改性后的燕麥β-葡聚糖與原燕麥β-葡聚糖在結(jié)構(gòu)上有很大區(qū)別，進(jìn)一步證明了本試驗(yàn)中硬脂酸對(duì)燕麥β-葡聚糖的改性成功。

圖7 燕麥β-葡聚糖硬脂酸酯的氫核磁表征Fig.7 Characterization of oat β-glucan stearate by hydrogen nuclear magnetic resonance

2.5 CAC 的測(cè)定結(jié)果

芘在330 nm 的激發(fā)波長(zhǎng)下熒光光譜中會(huì)出現(xiàn)4 個(gè)振動(dòng)峰，分別為I1（374 nm）、I2（380 nm）、I3（385 nm）和I4（394 nm）[27]。當(dāng)聚合物的濃度較低時(shí)，其只以單鏈形式存在，熒光強(qiáng)度不發(fā)生變化，然而當(dāng)濃度高于CAC 時(shí)，芘分子會(huì)進(jìn)入到疏水內(nèi)核并強(qiáng)烈發(fā)射，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增加，形成膠束[1]。I1/I3值的大小反映出溶液的極性大小，即數(shù)值越小，對(duì)應(yīng)其極性也越小。當(dāng)I1/I3的值出現(xiàn)急劇下降時(shí)，可以認(rèn)為芘由水中逐漸轉(zhuǎn)移至自聚集納米顆粒的疏水內(nèi)殼中，意味著自聚集體的正式形成[1，28-29]。在圖8中可以發(fā)現(xiàn)，OGE 的DS 與CAC 成負(fù)相關(guān)，即隨OGE 取代度的增加，臨界膠束濃度越小。當(dāng)DS=0.057，測(cè)得其CAC 為0.059 mg/mL；當(dāng)DS=0.082 時(shí)，其CAC 為0.039 mg/mL；當(dāng)DS=0.133時(shí)，其CAC 降至0.017 mg/mL。與文獻(xiàn)[2]報(bào)道的兩親性多糖在低濃度下即可形成自聚集膠束的結(jié)論一致。

2.6 OGE 的溶解度

如表3所示，OGE 的溶解度較原燕麥β-葡聚糖的溶解度有不同程度的降低。隨著OGE 取代度的增加，溶解度迅速下降。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因是引入了硬脂酸這種疏水基團(tuán)，取代度越高，引入的疏水集團(tuán)越多，其溶解度相應(yīng)越低。

圖8 不同取代度的OGE 的臨界聚集濃度Fig.8 The critical aggregation concentration of OGE with different degrees of substitution

2.7 OGE 的細(xì)胞毒性

當(dāng)OGE 作用于正常的Raw264.7 細(xì)胞時(shí)，可以看出不同取代度下的OGE 質(zhì)量濃度高低對(duì)Raw264.7 細(xì)胞有著不同的作用效果。總體來(lái)看，當(dāng)OGE 質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞活力有所下降，然而均保留了99%以上的細(xì)胞存活率，可以認(rèn)為在此質(zhì)量濃度（20～200 μg/mL）范圍內(nèi)，改性后的兩親性多糖對(duì)細(xì)胞并無(wú)毒性。隨著取代度的不斷升高，對(duì)Raw264.7 細(xì)胞的活力也呈增強(qiáng)作用。分析圖9可知，當(dāng)OGE 質(zhì)量濃度為100 μg/mL 時(shí)，不同取代度下的兩親性多糖對(duì)細(xì)胞活力均具有最好的作用效果。當(dāng)取代度為0.057 時(shí)，與不加OGE 的細(xì)胞活力相比，質(zhì)量濃度為50 μg/mL的OGE 可顯著促進(jìn)Raw264.7 細(xì)胞的增殖 （P＜0.01），當(dāng)OGE 質(zhì)量濃度增加至100 μg/mL 時(shí)，對(duì)Raw264.7 細(xì)胞活力仍存在顯著促進(jìn)作用 （P＜0.05）；取代度為0.088 時(shí)，質(zhì)量濃度為50 μg/mL和100 μg/mL 的OGE 均可顯著促進(jìn)Raw264.7 細(xì)胞的增殖（P＜0.05）；當(dāng)取代度為0.102 時(shí)，OGE 質(zhì)量濃度為25，50，100 μg/mL 時(shí)，對(duì)正常Raw264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)都具有極顯著地促進(jìn)作用（P＜0.01）。

表3 不同取代度的OGE 的溶解度Table 3 Solubility of OGE with different degrees of substitution

圖9 不同取代度的兩親性多糖對(duì)Raw264.7細(xì)胞活力的影響Fig.9 Effects of amphiphilic polysaccharides with different degrees of substitution on the viability of Raw264.7 cells

3 討論

本文利用飽和脂肪酸硬脂酸對(duì)燕麥β-葡聚糖進(jìn)行酯化改性后，通過(guò)OGE 的紅外光譜圖和氫核磁結(jié)構(gòu)表征圖能夠得出改性后的兩親性燕麥β-葡聚糖與原糖結(jié)構(gòu)具有一定區(qū)別，進(jìn)一步證明試驗(yàn)中兩親性燕麥β-葡聚糖酯的成功制備。通過(guò)對(duì)制備條件的優(yōu)化，得出當(dāng)硬脂酸活化液添加量為6.50 mL、反應(yīng)溫度為90℃且酯化反應(yīng)時(shí)間為5.0 h 時(shí)有最大取代度，可達(dá)0.133。OGE 能夠在較低質(zhì)量濃度之下形成膠束，且溶解度隨取代度的增加而明顯降低。在用改性后的兩親性燕麥β-葡聚糖在較低濃度下作用于正常Raw264.7 細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活力均在99%以上，可以認(rèn)為制備的OGE 在一定濃度范圍內(nèi)無(wú)細(xì)胞毒性。

有學(xué)者指出，兩親性多糖由于疏水性嵌段的存在，能夠有效地荷載某些敏感性生物活性材料，防止這些物質(zhì)快速崩解，使它們?cè)诘竭_(dá)目標(biāo)位置時(shí)更加有效的釋放[30]。本試驗(yàn)中兩親性多糖材料易得，且制備過(guò)程較為簡(jiǎn)單，對(duì)正常細(xì)胞不具有毒性，有望在荷載疏水性活性物質(zhì)或者食品相關(guān)領(lǐng)域成為具有應(yīng)用價(jià)值的載體，提高疏水性生物活性材料等的生物利用率。