張強(qiáng)輝 姜玉庭 李超杰 趙 騰 張恒端 邢 丹 董言德 李春曉 趙彤言 郭曉霞

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

白紋伊蚊Aedes albopictus是多種蟲(chóng)媒傳染病如登革熱、寨卡病毒病等的傳播媒介。白紋伊蚊廣泛分布于我國(guó)亞熱帶和溫帶地區(qū)，根據(jù)氣候差異，亞熱帶地區(qū)又分為南亞熱帶、中亞熱帶和北亞熱帶3個(gè)氣候區(qū)(Bonizzonietal., 2013)。白紋伊蚊滯育卵或離水干燥的卵是白紋伊蚊度過(guò)寒冷冬季和旱季的主要蟲(chóng)態(tài)。位于不同氣候區(qū)的白紋伊蚊地理株對(duì)滯育誘導(dǎo)因素的反應(yīng)以及滯育發(fā)生的強(qiáng)度不同，其代謝活動(dòng)和卵內(nèi)發(fā)生的生理、生化反應(yīng)也受到不同程度的抑制(Denlingeretal., 2014)。南亞熱帶地區(qū)為常綠闊葉林氣候，最冷月平均氣溫在10～15 ℃，白紋伊蚊長(zhǎng)期處于日照長(zhǎng)短變化和溫度變化幅度很小的地理環(huán)境，滯育卵只需低氧水的刺激便可孵化；而北亞熱帶地區(qū)為典型季風(fēng)落葉氣候，最冷月平均氣溫低至0 ℃(焦北辰,1984)，冬季短光照、低溫對(duì)親代和卵的聯(lián)合作用，使白紋伊蚊滯育卵需經(jīng)過(guò)長(zhǎng)光照誘導(dǎo)和低氧水的刺激，打破滯育，才能遇水孵化(楊振洲,1988)。本研究主要通過(guò)模擬短光照周期誘導(dǎo)位于不同氣候區(qū)的白紋伊蚊滯育卵的生存情況和滯育狀況，探索位于我國(guó)不同氣候區(qū)的3株白紋伊蚊滯育卵生存和分布特點(diǎn)，了解白紋伊蚊滯育卵實(shí)現(xiàn)入侵和定殖的生物學(xué)基礎(chǔ)，為探索新型蚊媒防治手段提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白紋伊蚊實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖

實(shí)驗(yàn)所用白紋伊蚊分別為北京株(地理坐標(biāo)：N39°51′, E116°17′)、杭州株(地理坐標(biāo)：N30°16′, E120°12′)和廣州株(地理坐標(biāo)：N23°07′, E113°16′)，均于2019年野外采集后，帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)傳代五次。養(yǎng)殖室條件為(27±1)℃，(70±10)%相對(duì)濕度，光照周期為L(zhǎng)∶D=14 h∶10 h。成蚊飼養(yǎng)在25 cm×25 cm×25 cm的蚊籠中，用8%的糖水喂飼。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在養(yǎng)殖室內(nèi)，短光照誘導(dǎo)白紋伊蚊產(chǎn)滯育卵，光周期誘導(dǎo)從幼蟲(chóng)期開(kāi)始。實(shí)驗(yàn)組蚊蟲(chóng)在光周期L∶D=8 h∶16 h條件下養(yǎng)殖的為短光周期誘導(dǎo)組，在二齡幼蟲(chóng)期間接受短光周期誘導(dǎo)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對(duì)照組蚊蟲(chóng)在光周期L∶D=16 h∶8 h條件下養(yǎng)殖，每組養(yǎng)殖4籠蚊蟲(chóng)(200/籠)，成蚊用8%的糖水飼養(yǎng)喂飼。

1.3 卵的保存

短光照組和對(duì)照組雌蚊在吸食昆明小鼠血液后，濾紙浸濕后放入卵杯供蚊蟲(chóng)產(chǎn)卵。4 d后取出卵紙，空氣干燥，放入盛有飽和鹽溶液的卵缸內(nèi)使胚胎發(fā)育完全后，保存于對(duì)應(yīng)光周期的光照培養(yǎng)箱內(nèi)。保存對(duì)照組的卵的光照培養(yǎng)箱條件為：光周期L∶D=16 h∶8 h，恒定相對(duì)濕度為90%，溫度為10 ℃。短光照組的卵置于光照培養(yǎng)箱的條件為：L∶D=8 h∶16 h，恒定相對(duì)濕度為90%，溫度為0 ℃，以此模擬冬季野外環(huán)境氣候。

1.4 白紋伊蚊滯育卵的發(fā)育情況變化

本研究基于模擬冬季野外氣溫條件保存卵的實(shí)驗(yàn)處置，對(duì)處于不同發(fā)育時(shí)期的白紋伊蚊滯育卵設(shè)置時(shí)間節(jié)點(diǎn)，觀察不同產(chǎn)卵后天數(shù)(days post-oviposition, dpov)的白紋伊蚊卵發(fā)育情況的變化，可分為3 dpov，胚胎發(fā)育期產(chǎn)卵后7 dpov，滯育前期產(chǎn)卵后11 dpov，滯育中期產(chǎn)卵后21 dpov，滯育后期產(chǎn)卵后40 dpov。通過(guò)在顯微鏡下觀察卵的狀態(tài)鑒定存活情況，破碎、干癟的卵為不能孵化的胚胎。發(fā)育完全的白紋伊蚊卵胚:胚胎占滿整個(gè)卵,胚帶延伸,節(jié)間溝加深，節(jié)間溝延伸到背部,三胸段已經(jīng)融合,可見(jiàn)腹節(jié);腕節(jié)明顯。

1.5 白紋伊蚊滯育卵的判斷及滯育率計(jì)算

取上述不同時(shí)間點(diǎn)的蚊卵，觀察白紋伊蚊滯育率的變化，采用food slurry方法進(jìn)行孵化(Poelchauetal., 2014)。500 mL自來(lái)水中加入500 mg幼蟲(chóng)飼料在養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)發(fā)酵24 h,用低氧水刺激滯育卵孵化,并在孵化過(guò)程中不斷攪動(dòng)給以刺激。抽取約300個(gè)卵孵化24 h后將卵紙取出，放置于對(duì)應(yīng)光周期的培養(yǎng)箱中，7 d后進(jìn)行第2次孵化，計(jì)出兩次孵化出的幼蟲(chóng)數(shù)，將卵紙取出并在顯微鏡下記錄破殼數(shù)。孵化率(%)=孵化的幼蟲(chóng)數(shù)/孵化的卵總數(shù)×100%。

未孵化的完整卵用漂白液(Trpi?, 1970)進(jìn)行漂白(配方為次氯酸120 mL，冰醋酸80 mL加入去離子水定容至1 L，常溫避光儲(chǔ)存)，在顯微鏡下觀察拍攝。滯育卵的判斷標(biāo)準(zhǔn)：漂白后，滯育卵在反射光下通體呈現(xiàn)乳白色，卵胚發(fā)育完整，腹節(jié)分明，頭部有紅色眼點(diǎn)，頭部孵化刺骨化呈黃褐色。滯育率的計(jì)算按照以下公式：滯育率(%)=未孵化卵胚完整的卵數(shù)/(孵化的幼蟲(chóng)數(shù)+未孵化卵胚完整的卵數(shù))×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用R 3.6.3軟件進(jìn)行分析。不同組的滯育率和孵化率比較采用卡方檢驗(yàn)或者Fisher精確概率法。P值經(jīng)過(guò)Bonferroni校正并且P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作圖采用GraphPad Prism 8.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 短光照可誘導(dǎo)白紋伊蚊產(chǎn)滯育卵

卵的不同生存狀態(tài)如圖1所示。A圖為完整可發(fā)育的卵胚，卵胚完整且胚胎占滿整個(gè)卵，經(jīng)過(guò)漂白后胚帶延伸,節(jié)間溝加深,胚胎完全脫離卵殼，胸段已經(jīng)融合,可見(jiàn)腹節(jié)且腕節(jié)明顯；B圖為干癟的卵，被認(rèn)為是不能孵化的胚胎；C圖為滯育卵，此時(shí)卵胚通體呈現(xiàn)乳白色，卵胚發(fā)育完整，腹節(jié)分明，頭部有紅色眼點(diǎn)，頭部孵化刺骨化呈黃褐色。

圖1 不同形態(tài)的卵Fig.1 Different states of egg of Ae.albopictusA. 完整可孵化的卵胚；B.不能發(fā)育的卵；C. 滯育卵. A. Hatchable egg embryo; B. Undevelopable egg; C. Diapause egg.

2.2 光周期對(duì)不同地理株白紋伊蚊卵滯育率的影響

如圖2所示，基于模擬冬季野外氣溫條件保存卵，在短光照下，3個(gè)不同地理株白紋伊蚊卵的滯育率從7～21 dpov逐漸上升,趨于平緩至40 dpov并達(dá)到最高。同一地理株白紋伊蚊卵的滯育率在不同滯育階段有明顯差異；3個(gè)地理株北京株、杭州株和廣州株白紋伊蚊卵的滯育率在滯育前期11 dpov和滯育后期40 dpov統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著(χ2= 87.721，P<0.01;χ2= 27.449，P<0.01;χ2= 11.551，P<0.01)。如圖3所示，3個(gè)不同地理株白紋伊蚊滯育卵的滯育率在相同滯育階段也有明顯差異；在滯育前期11 dpov，滯育中期21 dpov和滯育后期40 dpov，北京株白紋伊蚊滯育率相比廣州株白紋伊蚊滯育率統(tǒng)計(jì)學(xué)上有明顯差異(χ2= 4.582，P<0.05;χ2= 11.520，P<0.01;χ2= 34.688，P<0.01)。杭州株和廣州株白紋伊蚊滯育率在滯育中期21 dpov和滯育后期40 dpov的統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(χ2= 11.520，P<0.01;χ2= 7.344，P<0.01)，但杭州株和廣州株白紋伊蚊滯育率在滯育前期11 dpov的統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著差異(χ2= 0.642，P>0.05)。

圖2 在短光周期下不同地理株白紋伊蚊的卵在不同時(shí)期的滯育率Fig.2 Diapause incidences of Aedes albopictus from different geographic strains in various periods under short-day photoperiodBJ：北京株白紋伊蚊；HZ：杭州株白紋伊蚊；GZ：廣州株白紋伊蚊.BJ：Ae. albopictus from Beijing; HZ：Ae. albopictus from Hangzhou; GZ：Ae. albopictus from Guangzhou.

圖3 在短光周期下不同地理株白紋伊蚊卵的滯育率Fig.3 Diapause incidences of Ae. albopictus from different geographic strains on 11, 21, 40 days post-oviposition under short-day photoperiod

2.3 不同地理株白紋伊蚊滯育卵孵化情況

如表1～3所示，觀察長(zhǎng)光照對(duì)照組和短光照組中3個(gè)地理株在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的卵的孵化率動(dòng)態(tài)變化。產(chǎn)卵后7 d孵化率相對(duì)較高，隨著低溫和光周期和聯(lián)合作用，自第7～40 d后觀察結(jié)束,孵化率逐漸降低至低點(diǎn)。長(zhǎng)光照對(duì)照組中3個(gè)地理株白紋伊蚊卵在滯育中期21 dpov和滯育后期40 dpov的孵化率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 3.402，P>0.05；χ2= 1.640，P>0.05；χ2= 2.532，P>0.05)；對(duì)于不同地理株，在長(zhǎng)光照光周期下亞熱帶地區(qū)杭州株和廣州株白紋伊蚊卵滯育后期的孵化率相比于北京株白紋伊蚊卵孵化率統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)意義(χ2= 1.280，P>0.05；χ2= 0.320，P>0.05)。短光照組中3個(gè)地理株北京株、杭州株和廣州株白紋伊蚊卵的孵化率在滯育前期11 dpov和滯育后期40 dpov分別有顯著差異(χ2= 8.858，P<0.01; χ2= 97.750，P<0.01; χ2= 89.914，P<0.01)；對(duì)不同光周期比較發(fā)現(xiàn)，滯育中后期產(chǎn)卵后第21 dpov后，3個(gè)地理株白紋伊蚊在短光照組的卵的孵化率比長(zhǎng)光照對(duì)照組的卵的孵化率低得多。對(duì)比不同地理株時(shí)，短光照下40 dpov時(shí)北京株白紋伊蚊的卵孵化率(21.45%)明顯比廣州株白紋伊蚊卵孵化率(8.15%)高(χ2= 20.117，P<0.01)。

表1 在不同光周期下北京株白紋伊蚊卵的孵化結(jié)果Tab.1 Egg hatch of Ae. albopictus from Beijing under different photoperiods

3 討論

滯育可使昆蟲(chóng)度過(guò)不良環(huán)境和維持種群的發(fā)育，以維護(hù)昆蟲(chóng)種群的繁衍生息。在白紋伊蚊的滯育反應(yīng)中，對(duì)光敏感的白紋伊蚊蛹或成年雌蚊能感知短日照的信號(hào)隨后產(chǎn)生后代后，其幼蟲(chóng)進(jìn)入卵的絨毛膜內(nèi)而滯育。滯育賦予白紋伊蚊較強(qiáng)的抗逆能力，與非滯育卵相比，白紋伊蚊的滯育卵對(duì)低溫(Hanson,1994)和干燥都有更強(qiáng)的抵抗力(Urbanskietal., 2010)。這些改變不僅有利于增加白紋伊蚊越冬存活率，更有利于經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸而實(shí)現(xiàn)全球大范圍迅速入侵新領(lǐng)地，進(jìn)而發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)蚊種(Monteiroetal., 2007)。1985年在美國(guó)發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)已知白紋伊蚊種群，究其本源可能是處于休眠狀態(tài)的白紋伊蚊卵通過(guò)汽車(chē)輪胎傳入(Hawleyetal., 1987)。對(duì)美國(guó)加州2001、2011年的白紋伊蚊種群進(jìn)行基因溯源分析(Zhongetal., 2013)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)匕准y伊蚊的來(lái)源種群有亞洲亞熱帶和溫帶地區(qū)的中國(guó)廣州株、廈門(mén)株白紋伊蚊。這些都表明探索阻遏白紋伊蚊滯育行為的新型蚊媒控制途徑的迫切性。

表2 在不同光周期下杭州株白紋伊蚊卵的孵化結(jié)果Tab.2 Egg hatch of Ae. albopictus from Hangzhou under different photoperiods

表3 在不同光周期下廣州株白紋伊蚊卵的孵化結(jié)果Tab.3 Egg hatch of Ae.albopictus from Guangzhou under different photoperiods

光周期是指自然日照時(shí)長(zhǎng)，呈穩(wěn)定的年周期性遞變的現(xiàn)象，是自然界中包括昆蟲(chóng)在內(nèi)的大多數(shù)溫帶動(dòng)物預(yù)測(cè)季節(jié)變化的主要信號(hào)(Meutietal., 2013)。溫帶氣候的月平均日照時(shí)長(zhǎng)短,白紋伊蚊溫帶株呈現(xiàn)的滯育誘導(dǎo)易對(duì)光周期敏感。雖然不同地理株白紋伊蚊會(huì)呈現(xiàn)一定的異質(zhì)性,但亞熱帶和溫帶白紋伊蚊品系皆具有滯育性。白紋伊蚊不同品系之間在短光周期(L∶D=8 h∶16 h)處理后滯育卵發(fā)生率在一個(gè)較大范圍內(nèi)波動(dòng),可能與白紋伊蚊營(yíng)養(yǎng)狀況或不同地理株品系相關(guān)。對(duì)我國(guó)2個(gè)地理品系白紋伊蚊進(jìn)行親代光周期誘導(dǎo)滯育卵的觀察發(fā)現(xiàn)(楊振洲,1988)，白紋伊蚊溫帶宜興品系(約北緯31° N)在光周期為以L∶D=8 h∶16 h可誘導(dǎo)卵期發(fā)生滯育；海南島白紋伊蚊熱帶品系(約北緯18° N)，短光周期的變化不能誘導(dǎo)卵期滯育；而溫帶宜興品系卵滯育率隨親代光周期縮短而增高的現(xiàn)象只發(fā)生在—定范圍內(nèi)(約9～15 h光照)。本研究的3個(gè)地理株分布位于溫帶地區(qū)的北京株和亞熱帶地區(qū)的杭州株和廣州株白紋伊蚊均能在短光周期條件(濕度(70±10)%、光周期L∶D=8 h∶16 h)誘導(dǎo)后產(chǎn)下滯育卵。實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期飼養(yǎng)北京地區(qū)白紋伊蚊滯育卵發(fā)生率在90%以上。Poelchau等(2013)利用短光周期(L∶D=8 h∶16 h)處理白紋伊蚊美國(guó)弗吉尼亞州實(shí)驗(yàn)室株的卵滯育率在87.5%～100%之間。本實(shí)驗(yàn)中分布于北京39.9°N，杭州30.3°N,廣州23.1°N野外采集的白紋伊蚊在短光周期誘導(dǎo)下滯育卵發(fā)生率也存在明顯差異，溫帶品系北京地理種群滯育率在40 dpov為90%以上，而亞熱帶的杭州株和廣州株白紋伊蚊地理種群滯育卵發(fā)生率明顯較低。這也說(shuō)明了亞熱帶、溫帶地區(qū)白紋伊蚊品系的光周期誘導(dǎo)滯育行為的存在較熱帶株地區(qū)白紋伊蚊品系具有更強(qiáng)的抗不良環(huán)境抵抗能力，亦或因溫帶地區(qū)地理氣候冬季低溫的影響，溫帶品系較熱帶品系的滯育深度更深且滯育歷期更長(zhǎng)。在40 dpov時(shí)，北京品系滯育率仍在上揚(yáng)，尚未達(dá)到平臺(tái)期，而杭州和廣州品系在21 dpov后基本趨勢(shì)呈現(xiàn)平緩，因而，溫帶和熱帶地理品系滯育歷期不同，其發(fā)生機(jī)制需進(jìn)一步探索。

亞熱帶和溫帶品系白紋伊蚊對(duì)短光周期敏感，短光周期下易滯育，但孵化率低 (Hawleyetal., 1987 , Urbanskietal., 2012)。本研究中不同地理株白紋伊蚊在長(zhǎng)光周期處理的卵的孵化率明顯高于短光周期的卵孵化率，廣州株白紋伊蚊在對(duì)照組長(zhǎng)光照下40 dpov的卵孵化率甚至高于50%，而在短光照周期下低于10%。說(shuō)明親代白紋伊蚊接受短光期的卵,孵化率明顯下降,同時(shí)短光期下相對(duì)低溫使卵的滯育程度進(jìn)一步加深。研究表明，影響滯育的主要環(huán)境因素是光周期和溫度 (Danks, 2004)。對(duì)位于美國(guó)北緯14° N的白紋伊蚊在21 ℃、26 ℃和29 ℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)滯育研究，發(fā)現(xiàn)29 ℃時(shí)滯育發(fā)生率較低甚至無(wú)法誘導(dǎo)滯育，而溫度較低的21 ℃和26 ℃可誘導(dǎo)滯育(Pumpunietal., 1992)。由此可見(jiàn)，溫度與光周期對(duì)白紋伊蚊滯育是聯(lián)合作用，但二者的相互作用關(guān)系仍不清楚。同時(shí)，影響滯育的因素不僅多而且內(nèi)外因子相互作用關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，大多數(shù)對(duì)其研究主要是光周期和溫度，其他如濕度等方面研究有待加強(qiáng)。本研究中位于溫帶地區(qū)的白紋伊蚊品系滯育程度較深,可能與卵的低溫保存有一定關(guān)系。因此，位于不同氣候區(qū)的白紋伊蚊可能會(huì)因冬季的環(huán)境溫度不同導(dǎo)致其越冬能力不同。同時(shí)全球氣候變暖，加之滯育卵越冬形式更使得白紋伊蚊逐漸由低緯度地區(qū)向高緯度地區(qū)擴(kuò)散，從而擴(kuò)大白紋伊蚊的分布范圍(Benedictetal., 2007)。

因此，通過(guò)白紋伊蚊的滯育生態(tài)學(xué)研究，深入分析白紋伊蚊滯育誘導(dǎo)、滯育解除、滯育后發(fā)育的機(jī)制，探求以白紋伊蚊滯育行為作為方向的新型蚊媒控制方法提供科學(xué)依據(jù)。