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        桉樹輪斑病原菌生物學特性分析

        2021-05-14 02:18:54廖旺姣鄒東霞鐘雅婷吳耀軍黃乃秀黃華艷
        廣西林業(yè)科學 2021年2期
        關鍵詞:分生孢子桉樹菌絲

        廖旺姣,鄒東霞,羅 輯,鐘雅婷,吳耀軍,黃乃秀,黃華艷

        (廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室廣西林業(yè)有害生物天敵繁育工程技術研究中心,廣西南寧 530002)

        桉樹(Eucalyptusspp.)是世界速生豐產(chǎn)造林樹種之一,具有生長快、伐期短、產(chǎn)量高、用途廣和效益好等優(yōu)點,已成為我國南方重要的用材林樹種和優(yōu)良的綠化樹種。廣西桉樹人工林發(fā)展迅速,從2000年的近15 萬hm2發(fā)展到2013年最高峰的200 多萬hm2。由于經(jīng)營管理不當,且純林面積不斷擴大,桉樹有害生物種類不斷增多,危害面積增加,災害日趨嚴重[1-4]。輪斑病是目前危害桉樹葉片的重要病害,可引起葉片大面積枯死,嚴重時,整株桉樹80%葉片出現(xiàn)干枯,林地發(fā)病率可達100%,嚴重影響桉樹的生長和木材蓄積[5]。關于輪斑病的研究,目前主要集中在病原方面,黃翠流等[6]確定Pili?diella eucalyptorum和P.diplodiella為廣西桉樹輪斑病原菌,其中P.eucalyptorum主要危害桉樹幼林及成林葉片,P.diplodiella主要危害苗期葉片。關于病原菌基本生物學特性尚未見報道。本研究分析P.eucalyptorum在不同營養(yǎng)和理化環(huán)境條件下的培養(yǎng)特性,旨在為桉樹輪斑病發(fā)病規(guī)律和防治技術研究提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 供試菌株

        本試驗供試菌株為P.eucalyptorum,由廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院森林保護研究所提供。

        1.2 生物學特性研究

        1.2.1 病原菌培養(yǎng)

        將供試菌株從4 ℃冰箱取出,挑取菌絲接種在PDA 平板培養(yǎng)基(馬鈴薯200.00 g、葡萄糖20.00 g、瓊脂粉18.00 g 和水1 000 mL)中央[6],置于25 ℃恒溫箱暗培養(yǎng)6天,待菌落生長至近培養(yǎng)皿邊緣,用滅菌打孔器(內(nèi)徑為6 mm)在菌落邊緣打取菌塊,備用。

        從桉樹林地采集產(chǎn)孢的典型輪斑病病葉,用流動自來水沖洗干凈,75%酒精消毒表面,無菌水沖洗3次,然后用解剖刀刮下分生孢子,放入滅菌培養(yǎng)皿中,使用PDB 培養(yǎng)液(馬鈴薯200.00 g、葡萄糖20.00 g 和水1 000 mL)梯度配置分生孢子液,濃度為2.00×106個孢子/mL,備用。

        1.2.2 溫度對菌絲生長的影響

        設置5、10、15、20、25、28、30、35 和40 ℃九個溫度梯度,將菌塊接種至PDA 平板中央,分別放置于上述9 種溫度的恒溫箱中進行恒溫暗培養(yǎng),培養(yǎng)5天后用十字交叉法測量菌落直徑,每個溫度處理6個重復。

        1.2.3 pH對菌絲生長的影響

        制備PDB培養(yǎng)液,pH設置為2 ~12,間隔為1,用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)配,接種3塊菌塊至上述培養(yǎng)液中,不同pH 值培養(yǎng)液設置3個重復。培養(yǎng)條件為120 r/min、28 ℃。震蕩培養(yǎng)10天后,用100目紗網(wǎng)過濾收集菌絲,80 ℃烘干至恒重后稱量菌絲干重[7]。

        1.2.4 光照對菌絲生長的影響

        參考賴傳雅等[8]的試驗方法并略作修改,在PDA 平板中央接種直徑6 mm 的菌塊,待菌落生長到直徑30 ~40 mm后,分別置于全程暗處理、12 h光暗交替(40 W,燈皿距離20 cm,下同)、6 h/18 h 光暗交替(40 W)、全程光照(40 W)、紫外光12 h 光暗交替(20 W)、紫外光6 h/18 h 光暗交替(20 W)和全程自然光7 種光照條件,25 ℃恒溫培養(yǎng),培養(yǎng)6 天后測量菌落直徑,測量方法同1.2.2。

        1.2.5 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

        基礎培養(yǎng)基為Czapek 培養(yǎng)基[7],以等質(zhì)量的乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-木糖、D-麥芽糖、可溶性淀粉、阿拉伯樹膠粉、甘露醇、D-山梨醇置換其中的蔗糖,配置不同碳源培養(yǎng)基;以等質(zhì)量的蛋白胨、酵粉、牛肉膏、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、尿素、甘氨酸、DL-甲硫氨酸、DL-天門冬酰胺氮置換其中的硝酸鈉,配置不同氮源培養(yǎng)基。平板中央接種6 mm 菌塊,置于25 ℃恒溫箱中暗培養(yǎng),每種碳、氮源為1 個處理,每處理6 個重復,培養(yǎng)6 天后測量菌落直徑,測定方法同1.2.2。

        1.2.6 溫、濕度對分生孢子萌發(fā)的影響

        用移液器吸取適量的分生孢子液至凹面玻片,放入滅菌培養(yǎng)皿中,用保鮮袋包扎好,置于1.2.2 設置的溫度梯度恒溫箱中培養(yǎng),96 h 后在40×10 倍顯微鏡下鏡檢,觀察并記錄分生孢子萌發(fā)數(shù)量,隨機記錄100個分生孢子中萌發(fā)孢子數(shù),每個溫度處理6個重復。

        用移液器吸取適量的孢子液均勻涂抹于滅菌載玻片上,快速陰干后,分別放入相對濕度為100%+水滴、100%、90%、85%、75%、65%和50%的七個小容器中[7],不同處理重復3次。25 ℃保濕培養(yǎng)96 h后鏡檢其孢子萌發(fā)數(shù)[9]

        1.2.7 菌絲體和分生孢子致死溫度測定

        參考江正君等[10]試驗方法并略作修改,分別挑取培養(yǎng)6 天的菌絲和刮取病斑上的分生孢子,用無菌水制成懸浮液,分生孢子濃度為2.00 × 106個孢子/mL,分別用移液器吸取4 mL 至滅菌的試管(15.0 mm × 150.0 mm)中,置于40 ~60 ℃(梯度為2 ℃)恒溫水浴中處理10 min,迅速冷卻,然后用移液器分別吸取0.2 mL 菌絲體懸浮液和分生孢子液放入PDA 平板培養(yǎng)基上,用滅菌三角玻棒均勻涂布,每處理3 個重復,25 ℃培養(yǎng)6 天后檢查菌絲生長和分生孢子萌發(fā)情況。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同溫度對菌絲生長的影響

        不同溫度處理的菌落直徑差異顯著(P<0.05),菌絲在10 ~35 ℃均能生長,低于10 ℃或高于35 ℃均不利于病原菌菌絲生長(表1)。28 ℃時菌絲生長最快,菌落直徑為83.58 mm,是菌絲最合適的生長溫度;其次是25 ℃,菌落直徑為73.38 mm。溫度高于28 ℃時,菌絲生長急劇下降,30 ℃的菌落直徑為32.35 mm,較28 ℃菌落直徑小51.23 mm,說明高溫不利于菌絲生長。

        表1 不同溫度對桉樹輪斑病原菌菌絲生長的影響Tab.1 Effects of different temperatures on mycelial growth of P.eucalyptorum

        2.2 不同pH值對菌絲生長的影響

        不同pH 處理的菌絲干重差異顯著(P<0.05)(表2)。菌絲在pH 2 ~12 環(huán)境下均能生長,pH 為6時菌絲干重最重,說明該菌在弱酸性的條件下生長最好,其次是pH 5和7。菌絲在強堿條件下(pH 10、11 和12)生長較差,在強酸性條件下(pH 2 和3)生長也較差。說明強酸或強堿不利于菌絲生長。

        表2 不同pH處理對桉樹輪斑病原菌菌絲生長的影響Tab.2 Effects of different pH values on mycelial growth of P.eucalyptorum

        2.3 不同光照條件對菌絲生長的影響

        菌絲在6 h/18 h 紫外光光暗交替處理下生長速度最快,菌落直徑為82.03 mm,其次為12 h 光暗交替處理,菌落直徑為78.29 mm,與其他處理差異顯著(P<0.05);全光照、6 h/18 h 光暗交替和自然光照處理的菌落直徑分別為71.78、67.19和63.21 mm;全黑暗處理的菌絲生長速度最慢,菌落直徑為36.15 mm(表3)。

        表3 不同光照條件對桉樹輪斑病原菌菌絲生長的影響Tab.3 Effects of different light conditions on mycelial growth of P.eucalyptorum

        該菌在紫外光光暗交替處理下,6 h/18 h光暗交替處理菌絲生長比12 h 光暗交替處理要快,說明短時間紫外光處理有利于菌絲生長,長時間處理則不利于菌絲生長。日光燈處理時,6 h/18 h光暗交替處理下的菌落直徑比12 h 光暗交替處理要?。?2 h 光暗交替和全光照處理相比,菌絲生長較快,說明適度的日光燈處理有利于菌絲生長。

        2.4 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

        菌絲在不同碳源條件下均能生長,在乳糖和蔗糖培養(yǎng)基中生長快,菌落直徑分別為76.88 和76.85 mm,與山梨醇處理外的其他處理差異顯著(P<0.05),說明這兩種碳源適合菌絲生長;其次為D-山梨醇和D-葡萄糖,菌落直徑分別為74.62 和73.95 mm;在阿拉伯樹膠粉培養(yǎng)基上生長最慢,菌落直徑為55.22 mm,說明阿拉伯樹膠粉不適合菌絲生長(表4)。

        表4 不同碳、氮源對桉樹輪斑病原菌菌絲生長的影響Tab.4 Effects of different carbon sources and nitrogen sources on mycelial growth of P.eucalyptorum

        菌絲在蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)基上生長快,菌落直徑分別為81.59和79.48 mm,與其他氮源處理差異顯著(P<0.05);其次為硝酸鈉培養(yǎng)基,菌落直徑為59.64 mm;在尿素培養(yǎng)基上菌絲生長最差,直徑為6.27 mm,幾乎不生長,說明尿素會抑制菌絲生長。

        2.5 不同溫、濕度對分生孢子萌發(fā)的影響

        分生孢子在20 ~30 ℃均可萌發(fā),28 ℃時萌發(fā)率最高(72%);其次為25 ℃(48.67%);低于20 ℃和高于30 ℃,分生孢子不萌發(fā)(表5)。與菌絲生長結(jié)果相似,溫度高于28 ℃,分生孢子萌發(fā)率急劇下降,30 ℃時僅為20.00%,較28 ℃時低52.00%。

        表5 溫度對桉樹輪斑病原菌分生孢子萌發(fā)的影響Tab.5 Effects of different temperatures on conidia germination of P.eucalyptorum

        桉樹輪斑病原菌分生孢子在100%+水滴的條件下萌發(fā)率最高(62.00%),其次是相對濕度100%條件,萌發(fā)率為10%,在相對濕度低于100%的條件下均不能萌發(fā),說明該菌分生孢子萌發(fā)對濕度要求較高(表6)。

        表6 不同相對濕度對桉樹輪斑病原菌分生孢子萌發(fā)的影響Tab.6 Effects of different relative humidity conditions on conidia germination of P.eucalyptorum

        2.6 致死溫度測定

        菌絲經(jīng)40、42、44 和46 ℃處理10 min 后,在PDA 平板培養(yǎng)基培養(yǎng)6 天后仍然能生長,隨著溫度升高,菌絲生長量減少,經(jīng)48、50、52、54、56、58 和60 ℃處理的菌絲不能生長。分生孢子經(jīng)過40、42、44、46 和48 ℃處理10 min 后,在PDA 平板培養(yǎng)基培養(yǎng)6 天后仍能萌發(fā),長出菌絲,隨著溫度升高,萌發(fā)率降低;50、52、54、56、58 和60 ℃處理10 min 后,在PDA 平板培養(yǎng)6 天沒有長出菌絲。因此,本試驗確定該病原菌菌絲的致死溫度為48 ℃,分生孢子致死溫度為50 ℃。

        3 結(jié)論與討論

        病原菌生物學特性是病害早期診斷、預測與防治的基礎[11-12]。桉樹輪斑病原菌P.eucalyptorum的生物學特性目前國內(nèi)外未見報道。本研究結(jié)果表明,P.eucalyptorum菌絲在10 ~35 ℃均能生長,最適生長溫度為28 ℃,低于10 ℃或高于35 ℃均不利于病原菌菌絲生長;分生孢子在20 ~30 ℃均可萌發(fā),以28 ℃萌發(fā)率最高;分生孢子在飽和濕度且有水滴條件下萌發(fā)效果最好。這與廣西桉樹輪斑病發(fā)生規(guī)律相符。3—4月溫度較低、雨水較多、濕度較大,越冬病原菌開始活躍,5—8月溫、濕度較高,病害迅速擴展蔓延至高峰,9—11月持續(xù)高溫或者連續(xù)晴天,病斑擴展緩慢或停止。說明溫、濕度是影響林間病害發(fā)生和流行的主要因素。菌絲pH 生長范圍為2 ~12,最適pH 為6,說明弱酸環(huán)境有利于菌絲生長,這與方中達[7]報道的真菌對培養(yǎng)基pH 值最適度為3 ~6 的結(jié)果相一致。菌絲在以乳糖和蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中生長最佳,阿拉伯樹膠粉培養(yǎng)基中生長較差;氮源利用方面,菌絲在蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)基中生長最佳,尿素培養(yǎng)基中生長最差。合理使用氮肥能增強桉樹抗病性,減少病害發(fā)生,間接達到防治病害的目的,這與王義勛等[13]報道的油茶炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)生物學特性得出的結(jié)論相同。光照能加速該菌菌絲生長,不同光照及時間處理結(jié)果有差異。該菌菌絲和分生孢子對溫度敏感性存在差異,菌絲的致死溫度為48 ℃,分生孢子致死溫度為50 ℃,表明該菌的致死溫度較高。本研究結(jié)果表明桉樹輪斑病原菌菌絲生長受溫度、pH 值、光照、碳源和氮源影響明顯,病原菌對環(huán)境的適應能力較強。

        本研究通過生物學特性試驗基本明確了P.eu?calyptorum菌絲最適生長條件,該供試菌株在培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢,且菌株衰退明顯,不利于后續(xù)研究,可對P.eucalyptorum的產(chǎn)孢條件進行研究。

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