聶佳佳

(上海市第八人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200233)

胰腺癌是惡性程度極高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，患者預(yù)后極差，5年生存率低下。吉西他濱是用于胰腺癌治療的一線化療藥物，但單藥治療的臨床獲益有限，聯(lián)合順鉑、5-氟尿嘧啶等其他化療藥物或厄洛替尼等靶向藥物的不良反應(yīng)大,且尚無足夠證據(jù)表明聯(lián)合用藥能獲得更理想的生存獲益[1-2]。五味子甲素是中藥五味子中的一類木質(zhì)素化合物，多項(xiàng)胰腺癌相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[3-4]表明，五味子甲素能夠抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，表明五味子甲素可能具有抗胰腺癌的潛在作用過于絕對。有實(shí)驗(yàn)[5]表明，五味子甲素能夠協(xié)同吉西他濱抑制肝癌細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路的激活。但五味子甲素與吉西他濱聯(lián)用是否能夠協(xié)同抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、以及是否抑制β-catenin通路的激活均尚不明確。為此，本實(shí)驗(yàn)將以胰腺癌PANC-1細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對象，具體分析五味子甲素協(xié)同吉西他濱調(diào)控β-catenin通路抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的作用。

1 材料與方法

1.1材料 胰腺癌PANC-1細(xì)胞株購自ATCC公司，五味子甲素購自MCE公司，MTS法細(xì)胞活力檢測試劑盒購自Promega公司，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)購自Sigma公司，RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒北京索萊寶公司，B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated x protein，Bax)、細(xì)胞周期素D1(cyclinD1)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(Phosphorylation Glycogen synthase kinase3β，p-GSK-3β)購自Abcam公司。

1.2方法 PANC-1細(xì)胞在含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)，每2 d更換1次完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至80%后用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化并傳代。傳代后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行分組給藥，對照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理；吉西他濱組用含有50 μg/mL吉西他濱的培養(yǎng)基處理；五味子甲素組用含有25 μmol/L五味子甲素的培養(yǎng)基處理；吉西他濱+五味子甲素組用含有50 μg/mL吉西他濱及25 μmol/L五味子甲素的培養(yǎng)基處理。將PANC-1細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，分組給藥后24，36，48 h時(shí)，采用MTS法細(xì)胞活力檢測試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，向每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μL檢測液并在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，而后取出培養(yǎng)板、在酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長的吸光值A(chǔ)490。將PANC-1細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，分組給藥后48 h時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，80%冷甲醇-20℃固定過夜；次日，離心收集細(xì)胞并調(diào)整密度至1×107/mL，取100 μL細(xì)胞懸液、加入400 μL PI染液，避光孵育30 min，最后在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞周期。將PANC-1細(xì)胞接種在12孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組給藥后48 h時(shí)，棄培養(yǎng)基、保留細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取蛋白樣本，用BCA法試劑盒測定樣本中的蛋白含量，根據(jù)測定結(jié)果取含有20 μg蛋白的樣本進(jìn)行Western blot檢測。電泳后電轉(zhuǎn)移至NC膜，封閉1 h后孵育Bcl-2、Bax、cyclinD1、β-catenin、p-GSK-3β、β-actin一抗4過夜，次日孵育二抗1 h，最后將NC膜放入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，得到蛋白條帶簡述，根據(jù)條帶的灰度值計(jì)算表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件錄入數(shù)據(jù)，四組間計(jì)量資料的比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PANC-1細(xì)胞活力的比較 藥物干預(yù)24，36，48 h后，與對照組比較，吉西他濱組、五味子甲素、吉西他濱+五味子甲素組的A490水平均明顯降低(P<0.05)且吉西他濱+五味子甲素組的A490水平均明顯低于吉西他濱組、五味子甲素組(P<0.05)；吉西他濱組、五味子甲素組、吉西他濱+五味子甲素組內(nèi)干預(yù)24，36，48 h時(shí)A490的兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 四組PANC-1細(xì)胞活力的比較

2.2PANC-1細(xì)胞周期的比較 藥物干預(yù)48 h后，與對照組比較，吉西他濱組、五味子甲素、吉西他濱+五味子甲素組G0/G1期比例明顯增加，S期、G2/M期比例明顯降低(P<0.05)且吉西他濱+五味子甲素組G0/G1期比例明顯高于吉西他濱組、五味子甲素組，S期、G2/M期比例明顯低于吉西他濱組、五味子甲素組(P<0.05)。見表2。

表2 四組PANC-1細(xì)胞周期的比較

2.3PANC-1細(xì)胞中增殖及細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的比較 藥物干預(yù)48 h后，與對照組比較，吉西他濱組、五味子甲素、吉西他濱+五味子甲素組Bcl-2、cyclinD1的表達(dá)水平明顯降低，Bax的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)且吉西他濱+五味子甲素組Bcl-2、cyclinD1的表達(dá)水平明顯低于吉西他濱組、五味子甲素組，Bax的表達(dá)水平明顯高于吉西他濱組、五味子甲素組(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 四組PANC-1細(xì)胞中Bcl-2、Bax、cyclinD1的蛋白條帶

表3 四組PANC-1細(xì)胞中Bcl-2、Bax、cyclinD1表達(dá)的比較

2.4PANC-1細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的比較 藥物干預(yù)48 h后，與對照組比較，吉西他濱組、五味子甲素、吉西他濱+五味子甲素組β-catenin、p-GSK-3β的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)且吉西他濱+五味子甲素組β-catenin、p-GSK-3β的表達(dá)水平明顯低于吉西他濱組、五味子甲素組(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 四組PANC-1細(xì)胞中β-catenin、p-GSK-3β的蛋白條帶

表4 四組PANC-1細(xì)胞中β-catenin、p-GSK-3β表達(dá)的比較

3 討 論

五味子甲素是一種具有抗癌活性的木質(zhì)素類化合物，提取自中藥五味子，對胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲具有抑制作用[6-8]，也有研究[9]報(bào)道能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生停滯。本實(shí)驗(yàn)在使用五味子甲素處理胰腺癌PANC-1細(xì)胞后觀察到,細(xì)胞活力A490水平及細(xì)胞周期S期、G2/M期比例均降低，G0/G1期比例增加，表明五味子甲素能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期的進(jìn)程，與既往關(guān)于五味子甲素具有抑癌活性的研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)采用五味子甲素聯(lián)合吉西他濱處理胰腺癌細(xì)胞后觀察到，細(xì)胞活力A490水平及細(xì)胞周期S期、G2/M期比例的降低及G0/G1期比例的增加均較單用五味子甲素或單用吉西他濱更顯著。表明五味子甲素能夠協(xié)同吉西他濱抑制胰腺癌的增殖，五味子甲素聯(lián)合吉西他濱能夠取得更強(qiáng)的抗胰腺癌作用。

有研究[3,7]顯示，五味子甲素能夠在胰腺癌、肺癌中抑制Bcl-2、增加Bax的表達(dá)；另有研究[8,10]顯示，五味子甲素能夠在甲狀腺癌、卵巢癌中抑制cyclinD1的表達(dá)。Bcl-2和Bax是調(diào)控線粒體對細(xì)胞色素C通透性的分子，前者抑制細(xì)胞色素C釋放、后者促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，細(xì)胞色素C釋放后促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖[11]；cyclinD1參與細(xì)胞周期調(diào)控，能夠促進(jìn)細(xì)胞快速通過細(xì)胞周期的檢查點(diǎn)并進(jìn)行有絲分裂[12]。本實(shí)驗(yàn)在用五味子甲素干預(yù)胰腺癌細(xì)胞后觀察到：Bcl-2、cyclinD1表達(dá)減少，Bax表達(dá)增加，與既往其他研究關(guān)于五味子甲素調(diào)控基因表達(dá)的結(jié)果一致；在五味子甲素聯(lián)合吉西他濱干預(yù)后，Bcl-2、cyclinD1表達(dá)減少及Bax表達(dá)增加均較單用五味子甲素或單用吉西他濱更顯著，表明五味子甲素能夠協(xié)同吉西他濱調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞中增殖及細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，與其協(xié)同抑制細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的作用吻合。

本實(shí)驗(yàn)還對五味子甲素發(fā)揮上述協(xié)同作用的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探究。本實(shí)驗(yàn)在用五味子甲素及吉西他濱處理胰腺癌細(xì)胞后觀察到：細(xì)胞中β-catenin、p-GSK-3β的表達(dá)均明顯降低且五味子甲素聯(lián)合吉西他濱干預(yù)后，β-catenin、p-GSK-3β表達(dá)減少較單用五味子甲素或單用吉西他濱更顯著，表明五味子甲素能夠協(xié)同吉西他濱抑制胰腺癌細(xì)胞中β-catenin通路的激活，這可能是其協(xié)同發(fā)揮抗胰腺癌作用的分子機(jī)制。

綜上所述，五味子甲素具有協(xié)同吉西他濱抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的作用，該作用與靶向抑制β-catenin通路有關(guān)，但β-catenin通路在五味子甲素聯(lián)合吉西他濱抗胰腺癌中的直接作用仍有待今后更多的研究來證實(shí)。