李順鈞 浦蘇穎 王慧 李云霞

(1.上海市徐匯區(qū)大華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200237；2.上海市同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200065)

癲癇發(fā)作與患者腦組織多種細(xì)胞蛋白代謝有關(guān)，會(huì)導(dǎo)致多種基因模式發(fā)生改變[1]。miRNA參與癲癇發(fā)展主要是通過(guò)參與神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥發(fā)應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)元壞死、樹(shù)突生長(zhǎng)、膠質(zhì)細(xì)胞增生等過(guò)程，同時(shí)在癲癇網(wǎng)絡(luò)形成，神經(jīng)遞質(zhì)以及機(jī)體損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。J.Yuan等[3]研究指出，神經(jīng)系統(tǒng)因?yàn)楦鞣N病理改變，造成海馬內(nèi)回返興奮性環(huán)路形成，促進(jìn)癲癇發(fā)生。SCN2A在不同類型的癲癇患者中均有SCN2A基因突變，通過(guò)SCN2A編碼的神經(jīng)元電壓門(mén)在調(diào)控鈉離子通道中發(fā)揮重要作用[4]。有研究[5]顯示，靶向SCN2A基因治療癲癇效果明顯。本文旨在研究miRNA-132靶向SCN2A調(diào)控對(duì)癲癇大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物和主要試劑 清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，大鼠8～10周齡，平均(9.8±1.2)周齡，體重200～220 g,平均(210.4±5.2)g，由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本文研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑：大鼠抗小鼠Bcl-2、Bax、Akt抗體(英國(guó)Abcam公司)。

1.2方法 30只大鼠隨機(jī)分為模型組、過(guò)表達(dá)組、沉默組，各10只。使用127 mg/kg氯化鋰給予腹腔麻醉，24 h后給予1 mg/kg丁溴東莨菪堿進(jìn)行腹腔麻醉，30 min給予30 mg/kg 1%的匹羅卡品腹腔麻醉，按照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，如果無(wú)發(fā)作或者發(fā)作未達(dá)到Ⅳ級(jí)，每間隔30 min給予10 mg/kg匹羅卡品腹腔麻醉，出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)即建模成功。三組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中融合率在75%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，測(cè)量細(xì)胞密度后以每個(gè)六孔板中約4×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行種植，加入到3 mL新鮮培養(yǎng)基中之后進(jìn)行孵育培養(yǎng)(5%CO2、溫度溫度為37℃)的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞孵育到融合率在40%～80%之間時(shí)取1.5 μL的質(zhì)粒DNA溶于100 μL的雙抗培養(yǎng)基中(不含血清)，充分混合后進(jìn)行離心，在EP管中加入12 μL的PolyFect Reagent，上下重復(fù)顛倒5次進(jìn)行混勻處理，于室溫環(huán)境下進(jìn)行靜置5～10 min，吸去置于六孔板中的培養(yǎng)基，加入3 mL的新鮮完全培養(yǎng)基，在含有轉(zhuǎn)染復(fù)合體的EP管中加入含有血清和雙抗的600 μL完全培養(yǎng)基，上下重復(fù)顛倒2次后加入六孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行常規(guī)的換液處理，再次繼續(xù)24 h的培養(yǎng)，倒置，使用熒光顯微鏡下對(duì)熒光亮度進(jìn)行觀察，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集，提取細(xì)胞RNA，鑒定轉(zhuǎn)染效率，將轉(zhuǎn)染效率最高的質(zhì)粒組、空載組稀釋液接種于10 mm2培養(yǎng)皿中(PCR驗(yàn)證篩選)，將40 μL嘌呤霉素加入每孔后常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后棄培養(yǎng)液，選取經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證篩選的細(xì)胞進(jìn)行消化處理后稀釋，接種在24孔板中，最終建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的過(guò)表達(dá)組、沉默組。建模成功后處死大鼠，提取大鼠海馬區(qū)組織制作標(biāo)本，使用40 mL/L的多聚甲醛進(jìn)行固定，常溫下使用15%的EDTA脫鈣，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，HE染色。TRIzol提取細(xì)胞RNA，經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)RNA并定量，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，探針或SYBR反應(yīng)25 μL，反應(yīng)條件滿足：94℃ 5 min,94℃ 45 s,60℃ 1 min,40個(gè)循環(huán),設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)組和空白對(duì)照。將PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)前3～15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，調(diào)節(jié)基線，采用2-△△CT分析SCN2A基因表達(dá)。使用10%的胎小牛血清培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1 000～10 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積為200 μL。培養(yǎng)24，48，72 h后，每孔加MTT溶液(5 mg/mL PBS配置)20 μL。繼續(xù)孵育4 h，結(jié)束培養(yǎng)，棄上清液。每孔中加入150 μL DMSO，振蕩10 min。選擇490 nm波長(zhǎng)，使用酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)各孔光吸收值。將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，將細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化5 min至細(xì)胞瓶表面呈霧狀，PBS吹打下來(lái)，4℃ 2 000 rpm 3 min，PBS洗滌、離心、重懸2次，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。常規(guī)蛋白提取，采取BCA法進(jìn)行定量分析。50 μg的蛋白樣品上樣后SDS-PAGE電泳，通過(guò)蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉TBST中進(jìn)行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液(Bcl-2、Bax、Akt按照1∶1 000比例進(jìn)行稀釋)，在4℃的環(huán)境中過(guò)夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液(Bcl-2、Bax、Akt按照1∶5 000比例進(jìn)行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入發(fā)光液ECL，曝光2～3次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參蛋白是GAPDH。

2 結(jié) 果

2.1病理學(xué)觀察 模型組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞腫脹，部分破裂，排列紊亂(黑色箭頭表示)；過(guò)表達(dá)組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞損傷明顯，細(xì)胞萎縮、腫脹、破裂嚴(yán)重，染色質(zhì)和細(xì)胞核濃縮。沉默組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞腫脹明顯降低。見(jiàn)圖1。

2.2SCN2A在癲癇大鼠中的表達(dá) 三組SCN2A mRNA表達(dá)分別為：模型組(1.26±0.21)、過(guò)表達(dá)組(0.56±0.15)、沉默組(1.62±0.32)。與模型組相比，過(guò)表達(dá)組SCN2A mRNA表達(dá)降低；沉默組SCN2A mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。與過(guò)表達(dá)組相比，沉默組SCN2A mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。三組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.227，P均<0.001)。

2.3海馬區(qū)細(xì)胞增殖率的比較 與模型組相比，過(guò)表達(dá)組海馬區(qū)細(xì)胞增殖率降低，沉默組海馬區(qū)細(xì)胞增殖率升高(P<0.05)。與過(guò)表達(dá)組相比，沉默組海馬區(qū)細(xì)胞增殖率升高(P<0.05)。模型組在24，48，72 h細(xì)胞增殖率逐漸升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，過(guò)表達(dá)組逐漸降低，沉默組逐漸升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞增殖率比較

2.4海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率的比較 與模型組相比，過(guò)表達(dá)組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率升高，沉默組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。與過(guò)表達(dá)組相比，沉默組海馬區(qū)細(xì)胞細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。模型組在24，48，72 h細(xì)胞凋亡率逐漸升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，過(guò)表達(dá)組逐漸升高，沉默組逐漸降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率比較

2.5Western blot檢測(cè) 與模型組相比，過(guò)表達(dá)組Bcl-2表達(dá)升高，Akt、Bax蛋白表達(dá)降低，沉默組Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Akt、Bax表達(dá)升高(Akt、Bax表達(dá)升高不甚明顯)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與過(guò)表達(dá)組相比，沉默組Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Akt、Bax表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

3 討 論

miRNA屬于一種短非編碼調(diào)控RNA，在調(diào)控基因表達(dá)方面效果顯著。且可作為診斷癲癇潛在的生物標(biāo)記因子[6-7]。miR-132屬于一種活性依賴RNA，在神經(jīng)元具有高度保守性并且相關(guān)含量較為豐富。癲癇的發(fā)生主要與多種編碼電壓門(mén)控性鈉離子通道基因突變有關(guān)，其中主要集中在編碼鈉離子通道α亞基SCN1A、SCN2A和編碼β亞基的基因 SCN1B中發(fā)現(xiàn)[8]。SCN2A的基因突變與全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥、良性家族性新生兒-嬰兒驚厥、兒童難治性癲癇有關(guān)[9]。L.Xia等[10]指出，miR-132表達(dá)水平與癲癇的發(fā)作有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，沉默組與過(guò)表達(dá)組和模型組相比，SCN2A mRNA表達(dá)升高，說(shuō)明沉默miR-132，能夠上調(diào)SCN2A mRNA表達(dá)。在體外細(xì)胞研究中顯示，抑制miR-132-3p，細(xì)胞中的SCN2A表達(dá)升高，證實(shí)miR-132-3p與SCN2A之間具有抑制關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，沉默組在24，48，72 h細(xì)胞增殖率逐漸升高，并且與過(guò)表達(dá)組和模型組相比，各時(shí)間段海馬區(qū)細(xì)胞增殖率升高。說(shuō)明沉默miR-132能夠促進(jìn)海馬區(qū)細(xì)胞增殖。研究[11]指出，miR-132是一種抑癌基因,通過(guò)靶向調(diào)控相關(guān)因子對(duì)癌細(xì)胞增殖和凋亡起到抑制作用。本研究顯示，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)沉默組在24，48，72 h細(xì)胞凋亡率逐漸降低，與過(guò)表達(dá)組和模型組相比，其各時(shí)間段海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率降低。說(shuō)明沉默miR-132能夠抑制海馬區(qū)細(xì)胞凋亡。

miR-132誘發(fā)癲癇的途徑是通過(guò)影響影響突觸的結(jié)構(gòu)和功能。Bcl-2屬于一種常見(jiàn)的抑癌蛋白，Bax屬于一種凋亡誘導(dǎo)基因，兩者結(jié)合以二聚體的形式存在，在細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要重要作用。A.Skardoutsou等[12]指出，Bcl-2與Bax基因結(jié)合產(chǎn)生二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Akt是PI3K下游的靶蛋白，激活A(yù)kt能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)揮抗凋亡作用。本研究結(jié)果顯示，沉默組與過(guò)表達(dá)組和模型組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Akt、Bax表達(dá)升高。說(shuō)明miRNA-132沉默通過(guò)抑制Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Akt、Bax升高，從而抑制癲癇大鼠海馬區(qū)細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。

綜上所述，miRNA-132沉默能夠增強(qiáng)SCN2A表達(dá)，miRNA-132通過(guò)靶向調(diào)控SCN2A，能促進(jìn)癲癇大鼠海馬區(qū)細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。為miRNA-132在癲癇中的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。(本文圖1,圖2見(jiàn)封三)