周靜 黃文茂 秦利軍 韓麗珍

（貴州大學生命科學學院 農(nóng)業(yè)生物工程研究院 山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室 山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴陽 550025）

植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR）是指分布于植物根圍土壤中、可直接或間接地促進植株生長的微生物類群［1］，是微生物菌劑產(chǎn)品的核心和發(fā)揮促生效果的關鍵，也是微生物肥料重要的種質(zhì)資源［2］。微生物菌劑分為單菌劑和復合菌劑，單菌劑是由一種功能微生物制成；復合菌劑是由兩種或以上的有益微生物組成。相較于單菌劑，復合菌劑具有協(xié)同作用，通過分泌不同生理活性物質(zhì)，影響植株的生理代謝活動，促進植物的生長，具有種類更多樣、功能更齊全、促生效果更好的優(yōu)點［3］。近年來利用復合菌劑進行不同植物的接種研究也已見報道。張英等［4］研究發(fā)現(xiàn)由4株PGPR制備的微生物接種劑對盆栽紅三葉有顯著促生作用。由中間蒼白桿菌（Ochrobactrum intermedium）YCG1、 短 小 芽 胞桿菌（Bacillus pumilus）YCG2和枯草芽胞桿菌（B.subtilis）YCG3組成的PGPR復合菌劑可改善烤煙的農(nóng)藝性狀和煙葉的化學品質(zhì)，降低烤煙發(fā)病率［5］。然而，這些復合菌劑均是由單菌株發(fā)酵后混合配制而成，制備過程繁瑣耗時。混菌發(fā)酵又稱混合發(fā)酵，不僅可縮短發(fā)酵時間、提高發(fā)酵效率，還可節(jié)約生產(chǎn)成本［6］；在食品或醫(yī)學微生物研究中偶有報道，如利用瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）進行混合發(fā)酵后，獲得的活菌數(shù)較單菌株培養(yǎng)分別提高了1.8倍和10.2倍［7］；但混菌發(fā)酵用于制備促生菌復合菌劑的報道極少。同時，混菌發(fā)酵體系的構(gòu)建是一個復雜的過程，除了必須考慮體系內(nèi)不同微生物之間的相互作用外，適宜的培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件也是提高菌體生長量的重要途徑。研究顯示對9株益生菌混合培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方和條件優(yōu)化后，單位活菌數(shù)是優(yōu)化前的2倍［8］。顯然，建立優(yōu)良的混菌發(fā)酵體系，對復合菌劑的制備及更好發(fā)揮微生物功能具有重要意義。

項目組在前期研究中，從茶樹根際分離篩選到具有多種不同促生特性的4株細菌菌株，分別為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）HGD3、彎曲芽胞孢桿菌（B. flexus）HGD12、貝萊斯芽胞桿菌（B.velezensis）HP9和洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）P10，可以顯著促進辣椒或花生的生長［9-10］。為了便于田間的應用，減少復合菌劑制備的復雜程度，本研究擬利用以上4株無拮抗性的PGPR菌株構(gòu)建混菌發(fā)酵體系、優(yōu)化其培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件，并進行混菌發(fā)酵制劑的盆栽實驗，為下一步微生物菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及辣椒品種 供試菌株為P. putida HGD3、B. flexus HGD12、B. velezensis HP9和 B.cepacia P10，由項目組從茶樹根際分離、并保存于本實驗室。供試辣椒品種為遵辣9號。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，酵母浸出物5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0-7.2，121℃滅菌20 min；

基礎培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，Na2HPO44.0 g，NaH2PO42.0 g，MgSO40.5 g，CaCl20.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0-7.2，115℃滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 4株PGPR菌株的生長曲線測定及接種順序的確定 將-80℃甘油保藏的HGD3、HP9、P10、HGD12菌株各取100 μL分別接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，調(diào)節(jié)菌液OD600值為1.0。將4株菌株的活化菌液轉(zhuǎn)接于100 mL基礎培養(yǎng)基中，相同條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h測定OD600值，繪制各株菌的生長曲線，根據(jù)各菌株進入對數(shù)生長期的時間點確定接種順序。實驗設3個重復。

1.2.2 單因素及正交實驗優(yōu)化培養(yǎng)基 以菌體生長量為篩選指標，對不同碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖）、氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出物、硫酸銨、硝酸鈉）、碳氮比（20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1）進行優(yōu)化；以相同含碳量的4種碳源替代葡萄糖，以相同含氮量的4種氮源替代蛋白胨（表1）。單因素優(yōu)化在基礎培養(yǎng)基條件下進行，將活化菌液按接種順序依次接入，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，實驗設3個重復。以優(yōu)化結(jié)果設置3因素4水平正交實驗L16（43）（表2），最終確定培養(yǎng)基最優(yōu)配方。

1.2.3 單因子及響應曲面法優(yōu)化發(fā)酵條件 以優(yōu)化培養(yǎng)基為基礎，OD600值為評價指標，選擇培養(yǎng)溫度（20、30、37、45、50℃）、初始 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）、接種比例（1%、2%、3%、4%、5%）和裝液量（50 mL、100 mL、150 mL、200 mL培養(yǎng)基于250 mL三角瓶中）進行發(fā)酵條件優(yōu)化。

表1 碳氮源的類型及添加量Table 1 Type and dosage of carbon sources and nitrogen sources

表2 碳氮源的正交試驗表Table 2 Orthogonal experiment for carbon sources and nitrogen sources

以單因子優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件為中心點，運用Design Expert 8.0軟件，針對溫度、pH值、接種比和裝液量使用中值組合重新編碼，以菌體生長量為響應值，設計4因素3水平的響應面實驗（表3）。實驗均設置3個重復。運用回歸分析對擬合得到的方程和各因子進行方差分析，并對模型可靠性進行分析，預測優(yōu)化結(jié)果，并在預測的最優(yōu)條件下進行驗證。

1.2.4 混菌發(fā)酵菌液的盆栽實驗及促生效應評價 按優(yōu)化的混菌發(fā)酵體系制備PGPR復合菌液，混合菌液為4株菌培養(yǎng)液等比例混合；菌液離心后收集菌體，以無菌水重懸、調(diào)節(jié)OD600值為1.0備用。

以遵辣9號為實驗材料，選擇12-13 cm高的辣椒幼苗移栽至裝有300 g土壤的實驗盆中，每盆種植1株；移栽7 d后分別以復合菌液和單菌混合菌液進行灌根，每隔2 d一次，每株5 mL。以無菌水為對照組（CK），共3個處理組，每個處理設置5個重復。以第1次灌根為起始時間，30 d后測定幼苗的株高、鮮重、根重和葉綠素。

表3 響應面法設計的因素與水平表Table 3 Factors and levels designed by response-surface methodology

1.2.5 實驗設計及統(tǒng)計分析 正交實驗及數(shù)據(jù)分析利用SPSS20.0進行，響應曲面法根據(jù)Box- Benhnken中心組合設計方案，以Design-Expert 8.0.6進行分析。

2 結(jié)果

2.1 混菌發(fā)酵體系中4株PGPR菌株的接種順序確定

從4株菌的生長曲線可以看出（圖1），P.putida HGD3和B. flexus HGD12進入對數(shù)生長期的時間均約為3 h，B. velezensis HP9進入對數(shù)生長期的時間約為5 h，B. cepacia P10進入對數(shù)生長期的時間約為10 h。由此可知，混菌發(fā)酵體系的接種順序為首先接種P10，間隔5 h后接種HP9，再間隔2 h后同時接種HGD3和HGD12。

2.2 單因素實驗篩選碳、氮源及碳氮比

實驗通過不同碳源、氮源和碳氮比的基礎培養(yǎng)基進行混菌發(fā)酵，以OD600值作為評價指標（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復合菌的生長量隨碳源的不同變化較大，以蔗糖為碳源時，復合菌的生長最好，果糖作為碳源時的生長量最低。氮源對其生長影響更顯著，蛋白胨、牛肉膏、酵母浸出物等有機氮源有利于復合菌的發(fā)酵，以硫酸銨為氮源時尤不利于復合菌的生長。不同碳氮比對復合菌生長的影響表明20∶1時的生長弱于其余3個設定比例。

圖1 四株PGPR菌株在基礎培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curves of four PGPR strains in basal medium

圖2 不同碳、氮源及碳氮比對復合菌生長影響的單因素研究Fig.2 Single level studying of effect on the growth of compound agent under the conditions of different carbon, nitrogen sources and ratio

2.3 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基成分

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，棄去果糖、硝酸鈉和20∶1等3個值后，對碳源、氮源及碳氮比設計3因素4水平的正交試驗。從優(yōu)化結(jié)果（表4）和方差分析（表5）可以看出，3個因素對復合菌發(fā)酵影響最大的是氮源（B），其次是碳源（A），碳氮比（C）的影響最?。蛔罴训呐囵B(yǎng)基組合為A2B3C2。綜上可知，混菌發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：蔗糖18.65 g，酵母浸出物12.53 g，Na2HPO44.0 g，NaH2PO42.0 g，MgSO40.5 g，CaCl20.2 g，蒸餾水1 000 mL。進一步對最優(yōu)培養(yǎng)基配方進行驗證，結(jié)果顯示復合菌在最優(yōu)培養(yǎng)基中混菌發(fā)酵24 h的OD600值為1.805，相較于基礎培養(yǎng)基提高約10%。

2.4 單因子實驗考察發(fā)酵條件

環(huán)境條件對菌株的生長影響顯著。由圖3可知，溫度對復合菌的發(fā)酵具有一定的影響。30℃時對復合菌液的發(fā)酵最優(yōu)，45℃時的生長好于20℃，表現(xiàn)出復合菌液具有一定的耐熱性；但50℃時，復合菌不能生長。pH值的影響結(jié)果顯示，復合菌在pH4.0的培養(yǎng)基中無法生長，當pH值由5.0升高至7.0，復合菌的生長量也呈遞增關系，起始pH為7.0時最有利于復合菌的發(fā)酵；pH 8.0-9.0時，復合菌的生長次之。不同接種比的復合菌發(fā)酵液的OD600值差異顯著，3%接種比時菌液的生長量達到最高。裝液量影響培養(yǎng)基的溶氧量，當裝液量為50 mL時，復合菌生長量最大，隨著裝液體積的增加，發(fā)酵液的OD600值逐漸降低。

2.5 響應曲面法優(yōu)化復合菌發(fā)酵條件

2.5.1 響應面模型構(gòu)建及方差分析 根據(jù)Box-Benhnken中心組合設計響應面實驗，發(fā)現(xiàn)混菌體系的發(fā)酵受培養(yǎng)溫度、起始pH、接種比和裝液量的影響；復合菌在不同實驗條件下混合發(fā)酵24 h后，各組實驗的OD600值均有不同變化（表6）。對實驗數(shù)據(jù)進行擬合后得到的二次回歸方程預測模型如下：

Y=1.76+0.03A+0.025B+0.012-0.19D+0.021AB-7.000×10-3AC+0.033AD+4.250×10-3BC+0.021BD+8.0×10-3CD-0.04A2-0.039B2-0.022C2-0.041D2

式中：Y為OD600值，A為溫度，B為pH，C為接種比，D為裝液量。

對所得回歸方程模型進行顯著性檢驗和方差分析（表7），顯示實驗結(jié)果與模型二次回歸方程預測模型的失擬值為0.174 5，決定系數(shù)R2=99.45%，表明該方程擬合度高，能夠很好地預測混菌發(fā)酵體系的最適發(fā)酵條件。根據(jù)F值的大小可以確定，在所選因素水平范圍內(nèi)，4個因素對復合菌的OD600值的影響順序為：裝液量（D）＞溫度（A）＞pH（B）＞接種比（C）。

2.5.2 影響復合菌發(fā)酵的主要因素分析 響應曲面三維圖能夠直觀地將各因素之間的交互作用對響應值的影響程度呈現(xiàn)出來，根據(jù)表6中交互項的兩因素對復合菌OD600值的影響繪制響應曲面圖（圖4）。結(jié)合顯著性分析結(jié)果（表6）及響應曲面圖，溫度與pH對復合菌的發(fā)酵效果影響作用趨勢一致，即OD600值隨溫度和pH的增加均表現(xiàn)為先增加后降低，溫度與pH之間的交互作用顯著。從溫度與接種比的交互響應曲面圖可以看出，OD600值隨溫度的升高而增大，隨接種比的增加而增加，溫度與接種比之間的交互作用不顯著。而溫度與裝液量的交互影響上，OD600值隨溫度的增加呈小幅度增加后基本保持

不變，隨裝液量的增加而降低，溫度與裝液量這2個因素之間存在顯著的交互作用。相應地，pH與接種比之間交互作用不顯著，而pH與裝液量、接種比與裝液量之間交互影響顯著。

表4 正交試驗優(yōu)化結(jié)果Table 4 Optimized results of orthogonal experiment

表5 單變量方差分析結(jié)果Table 5 ANOVA analysis results of variance

圖3 環(huán)境因素對混菌體系發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of environm-ental factors on mixed fermentation

表6 Box-Benhnken中心組合試驗設計方案及結(jié)果Table 6 Experimental design and results of Box-Benhnken central combination

2.6 最佳條件參數(shù)確定及模型驗證實驗

通過Design-Expert 8.0.6進行優(yōu)化分析，在選擇的因素水平范圍內(nèi)，得到復合菌發(fā)酵的最佳條件參數(shù)為：當A為-0.030，B為0.045，C為0.097，D為-1.000時，即溫度為29.7℃，pH為7.045，接種量為3.19%，裝液量為50 mL/250 mL，可得到OD600值最大預測值為1.903。

以優(yōu)化后所得最佳發(fā)酵條件參數(shù)進行驗證實驗，實測OD600值為1.908±0.005，與預測OD600值的偏差為0.35%，說明該模型能夠很好地預測復合菌發(fā)酵的生長量；OD600值較優(yōu)化前提高了15.39%，混菌發(fā)酵液的活菌數(shù)為2.94×1014CFU/mL，而4株單菌混合菌液的活菌數(shù)為5.73×1013CFU/mL，混菌發(fā)酵的活菌數(shù)是優(yōu)化前單菌混合菌液活菌數(shù)的5.13倍。

表7 響應面二次回歸預測模型方差分析Table 7 ANOVA analysis of quadratic regression model of response surface

2.7 混菌發(fā)酵菌液的促生效應評價

辣椒盆栽實驗結(jié)果表明，經(jīng)由4株菌制備的混合菌液和混菌發(fā)酵菌液處理后，辣椒的生長均優(yōu)于對照組，尤以混菌發(fā)酵菌液的促生效果更好，根系發(fā)育情況更優(yōu)（圖5）。如表8所示，混菌發(fā)酵菌液灌根處理辣椒后，幼苗的株高、根重、鮮重及葉綠素含量均顯著高于對照組（P＜0.05），較后者分別提高了35.55%、179.51%、126.21%和17.26%；相較于單菌混合菌液組分別提高了8.01%、50.22%、43.66%和6.94%。

3 討論

混菌發(fā)酵體系的構(gòu)建是一個復雜的過程，篩選出最佳的碳源、氮源、碳氮比及適宜的發(fā)酵條件是構(gòu)建復合菌發(fā)酵的重要環(huán)節(jié)［11］。培養(yǎng)條件的優(yōu)化通常采用正交實驗或響應曲面法，大多被應用于微生物酶活性的提高、分泌抗生素或抗菌蛋白等有益產(chǎn)物等方面［12-15］，而在根際促生菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化方面研究較少［16］。有報道利用響應面法對紅樹林植物促生菌SZ7-1菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后，活菌數(shù)較優(yōu)化前提高了12.4倍［17］；經(jīng)響應面法、正交實驗優(yōu)化煙草根際分離菌株的發(fā)酵條件，均明顯提高了IAA產(chǎn)量［18-19］。王呈玉等［20］以高效玉米根際溶磷菌阿氏芽胞桿菌（B. aryabhattai）XF1和巨大芽胞桿菌（B. megaterium）XS2混合培養(yǎng)的菌株進行固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)和發(fā)酵工藝的優(yōu)化，培養(yǎng)4 d的活菌數(shù)達2.56×1010CFU/g；利用制備的菌劑進行玉米拌種施用，并同時減施35%的化學磷肥，結(jié)果顯示產(chǎn)量與常規(guī)施肥處理相當。顯然，培養(yǎng)條件的優(yōu)化對于促生菌菌數(shù)的增加或促生特性的提高仍是一條有用的途徑。本研究中，通過4株PGPR菌株生長曲線的測定，根據(jù)菌株進入對數(shù)期的時間確定了接種順序，以單因素和正交實驗優(yōu)化了培養(yǎng)基成分，繼而利用單因素和響應曲面法對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以此構(gòu)建了混菌發(fā)酵體系；驗證試驗表明，利用混菌發(fā)酵體系獲得的復合菌，其活菌數(shù)為2.94×1014CFU/mL，是單菌混合菌液的5.13倍，在相同的發(fā)酵時間內(nèi)獲得了更大的活菌數(shù)量，無疑可以節(jié)約時間、減少繁瑣程度，并大大降低生產(chǎn)成本。

圖4 各因素交互作用的響應面曲線圖Fig. 4 Response surface curve of interactions among factors

圖5 混菌發(fā)酵及單菌混合菌液對辣椒幼苗生長的影響Fig.5 Effects of mixed fermentation culture and single fermentation culture on the growth of pepper seedlings

隨著社會對發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)的重視及可持續(xù)發(fā)展意識的增強，使得以PGPR制成的新型生物菌劑部分或逐步取代化肥成為一種可能性。目前，對于微生物菌肥的研究應用已經(jīng)有向多菌復合發(fā)展的趨勢［21］。鄧振山等［22］利用從不同植物根及根際土壤中篩選到的多株促生菌對玉米進行混接，發(fā)現(xiàn)多菌優(yōu)于單菌接種。以膠質(zhì)類芽胞桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）3016和慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）5136進行雙接種，與單菌株接種相比，可顯著增加大豆的單株分枝數(shù)、粒數(shù)、收獲指數(shù)和占瘤率，降低單株空莢數(shù)，增加大豆產(chǎn)量［23］。利用根瘤菌和芽胞桿菌的雙接種試驗也增加了菜豆的結(jié)瘤和苗干重［24］。Egamberdieva 等［25］的研究還表明，利用慢生根瘤菌和惡臭假單胞菌進行雙接種，還通過改變根系構(gòu)型顯著提高了鹽脅迫下大豆植株的營養(yǎng)元素水平。但是，利用復合菌劑進行辣椒促生的研究報道很少，且復合接種多見于根瘤菌和其他不同種菌株的配合。Madhaiyan等［26］利用具不同促生特性的米亞甲基桿菌（Methylobacterium oryzae）與巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）或吡咯伯克霍爾德氏菌（B. pyrrocinia）分別構(gòu)建的雙菌株復合菌劑接種辣椒，較甲基桿菌菌株單接種而言，幼苗莖長分別增長了3.66%和3.82%，根長也略有增加；較對照的莖長分別增長8.33%和8.49%，較根長分別增加30.70%和21.00%。本項目在前期研究中，分別利用HGD3、HGD12、P10及HP9進行單菌株接種及不同組合的等比例混合接種，發(fā)現(xiàn)4個菌株等比例混合接種對辣椒幼苗的促生效果最優(yōu)，且幼苗的株高分別較4個單菌株增長27.69%、20.31%、19.42%和13.91%，根重分別增加39.26%、18.85%、1.79%和28.98%，鮮重分別增加32.60%、30.60%、14.18%和28.03%，表現(xiàn)出極為明顯的復合促生效應（未發(fā)表資料）。

表8 兩種不同復合菌劑對辣椒幼苗生長的影響Table 8 Effects of two different compound bacterial agents on the growth of pepper seedlings

微生物復合菌劑可提高單一微生物菌劑在農(nóng)業(yè)中的應用可靠性和有效性，但目前對其構(gòu)建方法的研究還不夠深入，大多根據(jù)菌株的不同功能以1∶1的形式構(gòu)建復合菌劑［27］，這可能忽略了不同菌株混合培養(yǎng)時之間的互作。韓梅等的研究就顯示互不拮抗的根瘤菌菌株S-2、溶磷菌菌株P-3和硅酸鹽細菌K-5的復合培養(yǎng)具有1+1+1＞3的溶磷效果，且S-2與P-3組合時的解鉀能力也由于單菌株［28］。本研究表明，對4株菌通過構(gòu)建混菌發(fā)酵體系，獲得的復合菌液接種辣椒，不僅可顯著促進辣椒的生長；且與4株菌株以等比例制備的混合菌液接種相比，辣椒的株高、根長、鮮重及干物質(zhì)重量分別提高了8.01%、50.22%、43.66%和6.94%，呈現(xiàn)出更顯著的促生效應；這也間接證實了4株菌在混合發(fā)酵的過程中，其促生特性可能有所提升，但深層的原因仍值得進一步研究。

4 結(jié)論

本研究以4株PGPR菌株構(gòu)建混菌發(fā)酵體系，采用單因素實驗、結(jié)合正交試驗及響應曲面法，對培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，最終確定的培養(yǎng)基組分為：蔗糖18.65 g，酵母浸出物12.53 g、Na2HPO44.0 g、NaH2PO42.0 g、MgSO40.5 g、CaCl20.2 g、 蒸 餾水1 000 mL。最適發(fā)酵條件為：溫度29.7℃、初始pH7.045、接種量3.19%、裝液量50 mL/250 mL。優(yōu)化混菌發(fā)酵體系獲得的活菌數(shù)為2.94×1014CFU/mL，是優(yōu)化前單菌混合菌液活菌數(shù)的5.13倍。利用混菌發(fā)酵制備的復合菌液灌根接種辣椒后，幼苗的生長指標及葉綠素含量均顯著高于單菌混合菌液組。