亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        新型冠狀病毒及其臨床檢測方法研究進展

        2021-05-14 06:01:38李家俊鄭瀟盛杰徐瑤
        生物技術(shù)通報 2021年4期
        關(guān)鍵詞:核酸特異性試劑盒

        李家俊 鄭瀟 盛杰 徐瑤

        (武漢科技大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)研究院,武漢 430081)

        2019年12月,一種新型冠狀病毒引起的肺炎在武漢爆發(fā)、流行,研究顯示新冠病毒具有人傳人的能力[1],且傳播能力強,R0約為 2.2[2]。2020 年1月12日,世界衛(wèi)生組織將2019新型冠狀病毒命名為2019-nCoV(后更名為COVID-19),2月11日,國際病毒分類委員會將新冠病毒命名為SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus2)。該病作為急性呼吸道傳染病已納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病,并采取甲類傳染病的預(yù)防、控制措施。據(jù)新華網(wǎng)報道,截至7月24日,中國本土累計確診病例86 500例,治愈80 738例,死亡4 656例,世界范圍更是確診超過1 500萬例,新冠病毒對全球公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了巨大威脅。準確快速確診新冠肺炎對于防控疫情,病患的及時合理治療非常關(guān)鍵。本文綜述了新型冠狀病毒的病原學(xué)特點與檢測方法的研究進展,簡要介紹了檢測技術(shù)的原理和應(yīng)用現(xiàn)狀,旨在為新冠肺炎的臨床準確診斷及疫情防控提供一些幫助。

        1 病原學(xué)特點

        SARS-CoV-2是發(fā)現(xiàn)的第7種β屬冠狀病毒[3],有包膜,顆粒呈圓形或橢圓形,常為多形性,直徑60-140 nm(圖1)。SARS-CoV-2遺傳物質(zhì)為單股正鏈RNA,基因組大小約為30 kb,為已知基因組最大的RNA病毒,具有5′帽結(jié)構(gòu)和3′PolyA尾巴結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄模式同2012年的SARS-CoV相似。SARS-CoV-2含有14個ORF共編碼27種蛋白質(zhì),5′端為一個約占基因組2/3的開放閱讀框架ORF1ab,編碼一個多肽蛋白,在一些病毒自身編碼的蛋白酶作用下加工裂解成15種非結(jié)構(gòu)蛋白,如RdRP和解旋酶??拷?′端約占基因組1/3的ORF編碼至少4種結(jié)構(gòu)蛋白,特異性結(jié)合宿主細胞受體的棘突蛋白(S),包膜形成相關(guān)的膜蛋白(M)、包膜蛋白(E),病毒組裝相關(guān)的核衣殼蛋白(N),輔助類蛋白基因分布在結(jié)構(gòu)蛋白基因之間[3-5]。

        圖1 新冠病毒結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the novel coronavirus structure

        目前研究顯示與蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat-SLCoVZC45)同源性達85%以上。體外分離培養(yǎng)時,2019-nCoV 96 h左右即可在人呼吸道上皮細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn),而在Vero E6和Huh 7細胞系中分離培養(yǎng)需約6 d。新型冠狀病毒對紫外線和熱敏感,56℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒,氯己定不能有效滅活病毒[6]。

        Hoffman和Zhou等[7-8]分別通過病侵染細胞試驗,證實了SARS-CoV-2使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶ACE2作為S蛋白受體進入細胞,Xu[9]利用模型模擬結(jié)合計算發(fā)現(xiàn)S蛋白與ACE2有很強的結(jié)合能-50.6 kcal/mol。ACE2蛋白在多種組織都存在低表達[10],但主要分布在肺泡上皮細胞和小腸上皮細胞等上皮細胞腔面。ACE2作為受體蛋白與病毒一起被內(nèi)吞進入細胞,導(dǎo)致細胞表面ACE2蛋白酶的減少,破壞了患者腎素-血管緊張素系統(tǒng)失衡,使得本身有基礎(chǔ)疾病如糖尿病、高血壓和心血管等患者感染后病情較重[11-13]。下呼吸道的病毒含量高于上呼吸道,呼吸道檢出率又高于血液。臨床上取樣優(yōu)先度,首先是下呼吸道樣本肺泡灌洗液、支氣管灌洗液,其次是深咳痰,接著是鼻咽部,最后是口咽部[14]。依據(jù)臨床取樣難度和患者接受程度,目前臨床最常用的標本是口咽拭子,其次是鼻咽拭子。重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標本(如支氣管或肺泡灌洗液、肺組織活檢標本等)。部分患者的檢測結(jié)果顯示糞便樣本與常用的咽拭子樣本具有同樣甚至更高的準確性[15],同時檢測兩份以上不同部位的樣本可以增加核酸檢出率。

        2 檢測方法

        病毒感染的實驗室檢查包括病毒分離與鑒定、病毒核酸檢測以及特異性抗體的檢測。

        2.1 病毒實驗室分離與鑒定

        病毒培養(yǎng)、分離與鑒定是實驗室鑒定病原體的金標準。Zhu等[16]將從3例患者的支氣管肺泡灌洗液分離到的病毒接種至人上皮細胞、Vero E6和Huh-7細胞株,96 h后在人氣道上皮細胞表層觀察到細胞病變,6 d后可以在Vero E6和Huh-7細胞株中觀察到病變。分離的病毒顆粒在透射電鏡下可以觀察到冠狀病毒日冕等獨特結(jié)構(gòu)。分離純化病毒為今后病毒生物學(xué)特征、致病機理研究、疫苗研發(fā)、抗病毒特效藥的研究奠定了基礎(chǔ)。但由于病毒的培養(yǎng)時間較長,技術(shù)要求較高,且必須在三級安全的生物實驗室內(nèi)進行,所以在疫情期間并不適合用于SARS-CoV-2的快速診斷。

        2.2 核酸檢測

        2.2.1 高通量測序 《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》中確診依據(jù)之一就是“病毒基因測序,與已知的新型冠狀病毒高度同源”。面對新型冠狀病毒引起的疫情,對病毒全基因組測序可以幫助人們了解病毒的遺傳信息,研究病毒進化與變異[17],解釋病毒毒力來源,病毒追蹤和溯源分析,為特異性的檢測試劑盒、疫苗研發(fā)提供支持。疫情爆發(fā)后,多個研究團隊[18-20]利用宏轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)確定了病毒的基因組,比較了不同冠狀病毒的異同,并對病毒基因組做了詳細系統(tǒng)發(fā)育樹分析,及時與多數(shù)據(jù)信息平臺分享,為各國疫情防控提供了數(shù)據(jù)支持。Wang等[21]建立了第三代測序納米孔靶向測序技術(shù),可在6-10 h內(nèi)同時檢測SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒。高通量測序技術(shù)優(yōu)勢在于高準確性,高通量、高靈敏,檢驗RT-PCR灰度可疑區(qū)的結(jié)果,避免RT-PCR由于樣本病毒低載量問題、引物或探針結(jié)合區(qū)存在突變位點導(dǎo)致的假陰性結(jié)果[22],同時還可以鑒定出其他的致病病原體,但由于檢測成本較高,檢測時間較長,且需要專業(yè)生物信息人員對測序結(jié)果進行解讀,所以不適合用于疫情高發(fā)期間臨床快速大規(guī)模檢測。

        2.2.2 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)按原理主要分為兩類(圖2),一類是通過嵌入式染料(如SYBR Green)在PCR擴增反應(yīng)過程中與擴增產(chǎn)生的雙鏈DNA結(jié)合,發(fā)射熒光信號,實現(xiàn)對PCR產(chǎn)物的實時定量檢測。另一種則通過熒光基團標記探針進行實時檢測,探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。熒光探針法特異性較高,探針可根據(jù)不同需求靈活設(shè)計,區(qū)分常見的冠狀病毒,對多個靶標同時進行檢測提高準確性同時防止漏檢,所以目前多數(shù)使用的都是熒光探針法。進一步說RTPCR分為一步法和兩步法,一步法相較兩步法而言,操作簡易快速,反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增檢測過程不相互獨立,提高樣本反應(yīng)濃度,減少開蓋次數(shù)有助于降低樣本與環(huán)境污染,因而多采用一步法。Corman等[23]使用熒光探針RT-qPCR法檢測新冠病毒ORF1ab、E、N三個靶標,再另外設(shè)計1條探針,用于區(qū)分2019-nCoV、SARS-CoV及bat-SAR的RdRP靶標。RT-PCR因其快速簡便、成本低、特異性高等特點是疫情期間使用最多最廣泛的核酸檢測方法,但檢測結(jié)果容易受到諸多因素影響而變成假陰性,應(yīng)多次檢測,確保結(jié)果的準確性。

        目前國家藥監(jiān)局批準了16種基于熒光PCR方法的新型冠狀病毒檢測試劑盒(表1),檢測靶標涉及ORF1ab、N、E三個基因,檢測靶標至少應(yīng)包括最為保守特異的ORF1ab區(qū)域。

        圖2 兩種熒光PCR示意圖Fig.2 Schematic diagram of two quantitative real-time PCR

        新冠病毒核酸檢測的陽性樣本檢出率僅有30%-50%[24],導(dǎo)致檢出率低的原因大致可分為以下幾類,可參考相應(yīng)的對策解決。(1)用于檢測的樣本不合格,樣本收集的過早或過晚,樣本采集保存運輸滅活方式不合適,樣本采集部位不同等原因?qū)е碌臉颖静《据d量不高,達不到檢出限。在采集樣本時應(yīng)盡量多收集各個部位的樣本混樣或者同時檢測,嚴格按照標準進行樣本采集、處理和轉(zhuǎn)運。Yang等[25]對6例新冠肺炎患者的鼻拭子、咽拭子、痰液和支氣管肺泡灌洗液進行檢測率比較發(fā)現(xiàn),除支氣管肺泡灌洗液(BALF)外,痰標本陽性率最高(74.4%-88.9%);其次為鼻拭子(53.6%-73.3%)。也有報道[26]患者糞便標本病原核酸檢測轉(zhuǎn)為陰性時間遠晚于呼吸道病原核酸檢測,提示可以參考糞便樣本檢測結(jié)果。(2)檢測試劑盒本身沒有經(jīng)過大量臨床樣本優(yōu)化,選用經(jīng)測試過包含多靶標的的試劑盒。郭元元等[27]對6種國產(chǎn)新型冠狀病毒核酸檢測試劑檢測性能比較發(fā)現(xiàn),不同試劑陽性檢出率不一致,重復(fù)率也不一致。靶標不一樣,檢出率也不一樣,N亞基因拷貝數(shù)多于ORF1a/b基因,但保守程度不及ORF1a/b,導(dǎo)致N基因擴增陽性而ORF1a/b基因陰性[28]。(3)技術(shù)本身存在局限性使得靈敏度不高,更換更靈敏的方法檢測。(4)檢測結(jié)果判讀困難,背景信號很強導(dǎo)致擴增曲線基線不準,一些灰度區(qū)的判讀。重新實驗,增加陰性、陽性和內(nèi)標質(zhì)控對照,以監(jiān)測各個環(huán)節(jié)有無異常,增加可信度。(5)病毒已經(jīng)發(fā)生了變異,引物結(jié)合區(qū)存在突變位點,更換試劑盒或檢測方法。

        2.2.3 實時熒光定量數(shù)字PCR(real time digital PCR,RT-dPCR) 樣本病毒載量過低是導(dǎo)致RT-qPCR檢出率低的一大方面原因,RT-PCR檢測原理決定了大多試劑盒的檢測靈敏度介于100-500拷貝。數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量技術(shù),采用微滴化方法,將大量稀釋后的核酸溶液分散數(shù)萬個微滴或芯片中,每個微滴反應(yīng)中的核酸模板數(shù)少于等于1個。擴增完成后,只有含有核酸分子模板的微滴反應(yīng)才會發(fā)出熒光信號,熒光收集后,分析軟件根據(jù)泊松分布原理及陽性反應(yīng)比例計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)。新冠肺炎病患出院的標準之一,兩次以上核酸檢測為陰性,但常有患者連續(xù)檢測結(jié)果呈陰性,卻在后來被證實為陽性的報道,建議RT-dPCR作為現(xiàn)行標準的補充[29],對即將出院的患者進行結(jié)果確認,有利于降低SARS-CoV-2疫情和社會恐慌的風(fēng)險。RT-dPCR具有高靈敏度,高特異性和低檢測線等優(yōu)點[30],能簡化判讀,分析成分復(fù)雜樣本,但由于配套試劑及設(shè)備昂貴、成本較高操作復(fù)雜、通量小易受污染等缺點,使得應(yīng)用受限。

        2.2.4 等溫擴增技術(shù) 傳統(tǒng)的體外核酸擴增技術(shù)需要精準控制溫度升降,且耗時較長(1-2 h),對樣本及實驗設(shè)備環(huán)境要求高,難以實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。20世紀90年代以來,相繼誕生了十幾種等溫擴增技術(shù),特點是能夠在固定反應(yīng)溫度下實現(xiàn)核酸的快速擴增和檢測。這里主要介紹RT-LAMP、RTRPA、恒溫擴增芯片3種等溫擴增技術(shù)在新冠肺炎檢測中的應(yīng)用,其他常見的等溫擴增技術(shù)如依賴核酸序列擴增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)、依賴解旋酶擴增(Helicase-dependent amplification,HDA)還未見有相關(guān)報道。

        2.2.4.1 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是在2000年由Notomi[31]首次提出,它在等溫條件下擴增DNA,具有高特異性、高效率、快速和低成本特點,1 h內(nèi)可擴增109倍。LAMP體系不同于一般的擴增反應(yīng)體系,它利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶,以及一對特殊設(shè)計的外部引物和一對內(nèi)部引物,使得能夠擴增形成具有特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA鏈,環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在內(nèi)部引物的結(jié)合區(qū),每經(jīng)過一個擴增循環(huán),環(huán)狀結(jié)構(gòu)就多了一倍,從而實現(xiàn)DNA的快速擴

        增。隨后在2002年,Nagamine等[32]改進了此種方法,增加一對環(huán)狀引物,將擴增時間縮短了一倍。LAMP最大的優(yōu)點是檢測可視化。伴隨著DNA迅速擴增,大量焦磷酸從底物dNTP中釋放出來,焦磷酸與溶液中的鎂離子反應(yīng),產(chǎn)生大量白色的焦磷酸鎂沉淀,溶液發(fā)生pH、鎂離子濃度、核酸含量和渾濁度4種變化。渾濁度可肉眼判斷[33],pH變化可用pH敏感的染料通過顏色的改變讀出擴增反應(yīng)結(jié)果[34],由于可能存在非特異性擴增序列,因此通過渾濁度及顏色檢測結(jié)果并不十分準確,可結(jié)合熒光探針提高檢測特異性的方法解決這一問題[35]。核酸含量變化可使用安全靈敏的核酸染料GeneFinder,在藍光照射下,100 copies/μL的陽性反應(yīng)即可肉眼觀察到清晰的綠色熒光,而陰性對照則保持粉紅色[36]。鎂離子濃度變化可通過添加鈣黃綠素實時監(jiān)測離子濃度變化[37],可以肉眼觀察到從橙色到綠色的顏色變化的陽性反應(yīng)。LAMP反應(yīng)靈敏度高,擴增迅速,可用于即時檢測,但易受到污染影響,引物設(shè)計復(fù)雜,需要有一定經(jīng)驗技術(shù)人員操作。

        表1 國家藥監(jiān)局新型冠狀病毒檢測試劑注冊信息Table 1 Registration information of novel coronavirus detection reagent in the National Medical Prodical Products Administration

        2.2.4.2 重組酶聚合酶擴增 重組酶聚合酶擴增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA) 是一種核酸恒溫擴增技術(shù),具有靈敏度高、特異性強、無需對樣品進行復(fù)雜處理等特點。RPA技術(shù)利用3種在常溫下仍具有活性的蛋白:結(jié)合單鏈核酸的重組酶,單鏈DNA結(jié)合蛋白SSB和鏈置換DNA聚合酶。重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物,能夠幫助引物定位在雙鏈DNA中同源序列,形成一個D環(huán)結(jié)構(gòu),然后鏈置換酶替換下DNA鏈,被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合,防止進一步替換,聚合酶啟動DNA鏈延伸的同時繼續(xù)打開模板DNA雙螺旋,整個過程十分迅速,一般可在十分鐘之內(nèi)獲得檢出水平的擴增產(chǎn)物,支持對樣品進行多重化定量分析。在RPA體系中加入反轉(zhuǎn)錄重組聚合酶,即能實現(xiàn)RNA的擴增。產(chǎn)物的檢測有多種方式,包括凝膠電泳、實時熒光定量、測流層析試紙等。RT-RPA能夠在檢測新冠病毒的同時快速區(qū)分多種常見的呼吸道病毒核酸[38],在食品衛(wèi)生方面也同樣能發(fā)揮作用[39],且特異性良好,與一般病毒無交叉反應(yīng)。RPA能在常溫條件下靈敏擴增,無需任何儀器,試劑凍干形式保存期長,檢測極限低,但由于引物長度需要30-35 bp,所以并不適合較短的靶序列擴增。

        2.2.4.3 恒溫擴增芯片 恒溫擴增芯片法的特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4對特異性物,利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下經(jīng)過非循環(huán)起始階段、環(huán)擴增階段、循環(huán)延伸階段,最終形成一系列有多個靶 DNA反向重復(fù)序列串聯(lián)的不同大小的產(chǎn)物,不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等步驟,整過程15-60 min即可完成[40]。恒溫芯片擴增法檢測也存在一些局限,它只是針對某一些病原體的檢測,往往會遺漏一些少見致病性病原體的檢出。3月26日,“6項呼吸道病毒核酸檢測芯片試劑盒”獲得國家藥監(jiān)局批準上市,該試劑盒能在1.5 h內(nèi)檢測包括新型冠狀病毒(2019-nCoV)在內(nèi)的6項呼吸道病毒。

        2.2.4.4 基于Cas酶的檢測技術(shù) CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種強大的基因編輯工具,同樣可以應(yīng)用在核酸檢測上。SHERLOCK(specific high sensity enzymatic reporter unlock)技術(shù)是 2017年張鋒[41]教授團隊開發(fā)的一種基于CRISPR靶向RNA的核酸檢測方法。方法原理,Cas13a在crRNA引導(dǎo)下檢測到目標RNA序列,則會激活一種非特異性的dsRNA酶切割活性,能夠切割體系中的RNA報告分子,熒光基團與淬滅基團分離,檢測到釋放出的熒光信號,與RT-RPA擴增技術(shù)、T7轉(zhuǎn)錄技術(shù)結(jié)合靈敏度可達渺摩爾級別,特異性精確到單堿基。之后張峰對SHERLOCK進行改進,使之能夠針對不同靶點進行多重檢測,結(jié)合Cas13和一種輔助CRISPR相關(guān)酶Csm6,靈敏度提高3.5倍,達到2個渺摩爾[42]。同年,5月6日,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準了一款基于SHERLOCK技術(shù)的新冠病毒檢測試劑盒,據(jù)研發(fā)公司稱檢測可以在大約1 h后返回結(jié)果。同樣基于CRISPR的檢測技術(shù)還有DETECTR,類似于SHERLOCK工作原理,不同的是DETECTR技術(shù)使用的非特異性核酸酶為Cas12a,Cas12a檢測識別DNA而不是RNA,因此在檢測新冠病毒時需增加反轉(zhuǎn)錄步驟。Broughton等[43]開發(fā)了一種基于DETECTR技術(shù)檢測SARS-CoV-2的方法,45 min即可在測流條上肉眼查看結(jié)果,陽性率達95%。基于CRISPR的核酸檢測技術(shù)目前還處于新興階段,該技術(shù)可無需特殊儀器輔助,反應(yīng)體積小又有很高的靈敏度精確度,方法成熟后可擴大通量檢測,因而顯示出極大的應(yīng)用發(fā)展前景。由于病毒的高變異性,如何提高crRNA靶向識別的特異性、反應(yīng)的穩(wěn)定性很是關(guān)鍵,相信經(jīng)過不斷優(yōu)化改進后可以廣泛運用在核酸檢測領(lǐng)域。

        2.2.5 抗體檢測 由于核酸檢測存在較高的假陰性,且耗時較長,對場地設(shè)備和技術(shù)人員要求較高,免疫學(xué)檢測因其快速可滿足現(xiàn)場檢測、診斷較為準確可輔助臨床確診,高滴度抗體血漿對重癥COVID-19患者的治療有所幫助,因此得到了越來越多的人重視?!缎滦凸跔畈《緜魅镜姆窝自\療方案(試行第七版)》首次將血清學(xué)檢測作為確診依據(jù)之一,新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG陽性或新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高也可確診。目前免疫學(xué)的檢測方法主要有膠體金免疫層析法、磁微粒化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA三種。

        2.2.5.1 膠體金免疫層析法 膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatography assay,GICA)以抗原抗體特異性免疫反應(yīng)為基礎(chǔ),利用膠體金顆粒作為示蹤物標記其中之一,標記物在溶劑層析作用帶動下,于C/T線上發(fā)生免疫反應(yīng),根據(jù)T線顏色即可得到檢測結(jié)果(圖3)。GICA的樣本可以是全血,血清或者血漿,研究表明膠體金檢測試劑檢測全血、血漿或血清具有高度一致性[44]。目前獲得國家藥監(jiān)局批準的膠體金試劑盒有7種全為檢測抗體,未有針對抗原的檢測試劑盒。以RT-qPCR檢測方法作為對照發(fā)現(xiàn),IgM/IgG抗體對于檢測的靈敏度和特異度不同,二者聯(lián)合檢測的檢出率最高為66.1%(125/189)[45]。膠體金試紙條法可用于企業(yè)復(fù)工、學(xué)生返校、社區(qū)人群排查等場景,只需要一滴指尖血,一般15 min即可肉眼觀察檢測結(jié)果,具有快速簡便無需特殊儀器等優(yōu)點,但是檢測存在窗口期、無法定量、有暴露風(fēng)險、靈敏度低和易受環(huán)境因素干擾等缺點,需要核酸檢測進行驗證。

        2.2.5.2 磁微?;瘜W(xué)發(fā)光法 磁微?;瘜W(xué)發(fā)光法利用表面固定重組抗原的磁微粒捕獲樣本中的特異性IgM/IgG抗體,外加磁場沉淀抗原抗體復(fù)合物,然后利用酶標二抗識別捕獲的二元復(fù)合物,之后加入發(fā)光劑后通過化學(xué)發(fā)光儀測定發(fā)光強度,從而定量分析的一種新興技術(shù),具有快速(一般30-60 min)、靈敏度高、特異性強、檢測范圍寬等特點。目前獲批的有7種磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒,最先獲批的博奧賽斯生物科技有限公司研發(fā)的試劑盒,搭配化學(xué)發(fā)光自動分析儀,可做到檢測速度240 T/H,首報告時間30 min。

        2.2.5.3 ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,保持其免疫活性,加入樣本后形成抗原-抗體復(fù)合物,之后再加入酶標記的抗原或抗體,形成三元復(fù)合物,洗滌后加入酶催化底物顯色,顏色深淺與待測樣本含量成正比,可通過酶標儀測得的吸光度大小定量分析。ELISA方法特異性主要取決于所用抗原的抗原性強弱,Liu等[46]評估了兩種基于不同抗原核蛋白、S蛋白的ELISA試劑盒COVID-19的檢測效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)214例確診新冠肺炎患者使用S蛋白抗原的試劑盒IgM/IgG陽性率均高于N蛋白,建議聯(lián)合二者檢測提高檢出率。ELISA方法具有特異性強,靈敏度高的特點,但整體檢測時間較長,通量較小,不利于基層大范圍展開應(yīng)用。

        研究數(shù)據(jù)顯示3種抗體檢測方法敏感性特異性均很高,總抗體檢測敏感性更高,建議免疫學(xué)檢測總抗體[47]。對患者體內(nèi)總抗體、IgM和IgG隨病情進展的動態(tài)變化進行分析[48]發(fā)現(xiàn),總抗體、IgM、IgG三者的陽轉(zhuǎn)時間中位數(shù)分別為11/12/14 d,而SARS-CoV-2抗原在1-5 d內(nèi)即可出現(xiàn),提示抗體檢測存在檢測窗口期,在發(fā)病后的7 d內(nèi)RNA陽性率為66.7%,抗體陽性率小于40%,而發(fā)病15 d后RNA陽性率下降到45.5%,總抗體陽性率則達到100%,說明隨著病程不同,核酸抗體檢測陽性率不同,在發(fā)病早期7 d之內(nèi)同時檢測核酸抗體可提高診斷敏感性。由于抗體的產(chǎn)生滯后時間較長,因此抗體檢測靈敏性不如核酸檢測,而且可能會與其他病毒產(chǎn)生抗體發(fā)生交叉反應(yīng),抗體水平易受到患者用藥影響,血液樣本中一些非特異性IgM、類風(fēng)濕因子等物質(zhì)容易產(chǎn)生干擾。IgM抗體一般在一周內(nèi)產(chǎn)生,提示近期感染,IgG抗體產(chǎn)生晚于IgM抗體出現(xiàn),但因為在體內(nèi)能存在較長時間,所以檢測可鑒別急性感染和既往感染,有利于病情的分型。基于上述原因,免疫學(xué)檢測不能替代核酸檢測,必須結(jié)合核酸檢測結(jié)果進行確診,可用來輔助核酸檢測,排查檢測陰性結(jié)果人群,發(fā)現(xiàn)無癥狀感染者,控制病毒的傳播。

        圖3 免疫膠體金原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of Immune colloidal gold technique

        3 結(jié)語

        目前新冠病毒的檢測方法主要以核酸、抗體檢測為主,又以核酸檢測結(jié)果陰性作為治療康復(fù)標準,因此樣本及選擇檢測方法至關(guān)重要,而造成檢測結(jié)果假陰性的大部分原因是采集的樣本病毒載量不合格或者處理保存不當(dāng)。不同病程的病人宜采用不同的采樣部位,同一患者不同部位采集樣本檢出率也不一樣,具體可參照國家發(fā)布的新冠診療方案和實驗室檢測技術(shù)指南進行操作。采集過程中應(yīng)盡量避免樣本RNA酶污染,使用帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的樣本采集管,樣本保存在如Hank’s病毒保存液中,必要時可以在保存液中添加RNA酶抑制劑。采集好的樣本應(yīng)盡快檢測,冷鏈運輸,2-8℃條件下轉(zhuǎn)運時間不應(yīng)超過72 h,24 h內(nèi)檢測的標本可置于4℃保存,24 h 內(nèi)無法檢測的標本則應(yīng)置于-70℃或以下保存,避免反復(fù)凍融。為保證實驗室生物安全,在抽提病毒RNA基因組之前需要進行病毒滅活,不同的病毒滅活方式對檢出率有影響,普遍采用的滅活方式為75%乙醇、56℃ 30 min處理。

        伴隨新冠患者不斷康復(fù)出院,治愈后“復(fù)陽”的病例也屢見不鮮,目前無確鑿證據(jù)表明新冠患者長期攜毒、存在二次感染,究其復(fù)陽原因可分為以下幾類:病毒潛伏較深,通過常規(guī)檢測方法無法發(fā)現(xiàn)它的存在,或者因為病毒含量較低達不到檢測線;糖皮質(zhì)激素等免疫抑制治療延長了帶毒期;復(fù)陽檢測出的核酸實際上是死病毒的核酸片段。最后一類假陽性問題可通過更換檢測目標為病毒亞基因組或者活病毒顆粒解決,其余都可歸結(jié)為假陰性問題。病毒樣本采集、保存運輸、預(yù)處理、核酸提取、擴增檢測任何一個環(huán)節(jié)都有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果,臨床上可通過綜合評定不同部位多次采樣多種檢測方法連續(xù)檢測結(jié)果、多種生化及影像學(xué)指標、分層管理個性化制定患者出院標準、出院隔離并定期復(fù)查等方式避免假陰性或“復(fù)陽”結(jié)果。

        新冠病毒的檢測方法有很多,各有優(yōu)劣,除上述筆者所述外,還有很多方法,如基因芯片,核酸適配體等。現(xiàn)場快速即時檢測產(chǎn)品POCT、方法的精確性、全自動流水線檢測、方法學(xué)上的優(yōu)化(如武漢全民體檢采用了混樣檢測策略)是以后檢測SARS-CoV-2的發(fā)展方向。隨著對新冠病毒的了解逐步加深,科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,相信會有更多更準確高效的檢測方法產(chǎn)品被研發(fā)出來,我們期待今后出現(xiàn)集核酸提取、快速擴增、檢測一體化的便攜式儀器和類似禽流感檢測商品化的抗體檢測試紙條,能夠方便普通民眾在社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心或者居家等場景自我篩查,以防疫情再次來臨時醫(yī)院等稀缺公共資源緊張的情況。

        猜你喜歡
        核酸特異性試劑盒
        測核酸
        中華詩詞(2022年9期)2022-07-29 08:33:50
        全員核酸
        中國慈善家(2022年3期)2022-06-14 22:21:55
        第一次做核酸檢測
        快樂語文(2021年34期)2022-01-18 06:04:14
        核酸檢測
        中國(俄文)(2020年8期)2020-11-23 03:37:13
        精確制導(dǎo) 特異性溶栓
        BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
        GlobalFiler~? PCR擴增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性
        GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗證
        重復(fù)周圍磁刺激治療慢性非特異性下腰痛的臨床效果
        兒童非特異性ST-T改變
        国99精品无码一区二区三区| 亚洲红杏AV无码专区首页| 中文字幕人成乱码中文| 无遮挡很爽很污很黄的女同| 天天做天天爱天天综合网2021| 亚洲精品国产成人AV| 精品黑人一区二区三区| 一本色道久在线综合色| 国产肉体xxxx裸体784大胆| 亚洲AV成人无码久久精品老人 | 中文字幕漂亮人妻在线| 岳好紧好湿夹太紧了好爽矜持| 国产成人久久精品二区三区牛| 综合久久青青草免费观看视频| 久久久精品人妻一区二区三区妖精| 成人毛片无码一区二区三区| 国产亚洲欧美成人久久片| 日本a一区二区三区在线| 熟妇人妻无乱码中文字幕av| 老熟妇仑乱视频一区二区| 99热门精品一区二区三区无码| 久久偷拍国内亚洲青青草| 无码av天天av天天爽| 疯狂做受xxxx高潮欧美日本| 8090成人午夜精品无码| 在线观看一区二区三区在线观看| 成人免费直播| 国产最新地址| 白白色青青草视频免费观看| 色噜噜亚洲男人的天堂| 亚洲国产综合精品 在线 一区| 久久无码高潮喷水抽搐| 粉嫩极品国产在线观看免费一区| 国产裸体舞一区二区三区 | 中文字幕无码免费久久9| 亚洲av高清一区二区在线观看| 男女做爰猛烈啪啪吃奶动 | 日韩极品视频在线观看免费| 亚洲av无一区二区三区久久蜜桃| 伊人久久精品久久亚洲一区| 国产清品夜色一区二区三区不卡|