王信林,應天昊,李曉麗,唐一迪,王艷芳,杜源,張雷明
(煙臺大學藥學院,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),山東 煙臺 264005)
膿毒癥(Sepsis)是由潛在或已知感染因素引起的全身炎癥反應綜合征(SIRS),常見于嚴重感染,燒傷,多發(fā)傷以及外科手術(shù)等病人,全球每年約有2 000萬患者[1]。近年來,盡管抗炎、抗感染和器官功能支持等療法取得了較大的進步,但膿毒癥病死率仍高達30%以上[2]。
膿毒癥屬“厥證”“脫證”“厥脫”等范疇[3]。長期的臨床實踐證實,中醫(yī)藥治療膿毒癥具有獨特的優(yōu)勢。在此次新冠肺炎疫情中,新冠肺炎危重癥患者會出現(xiàn)膿毒癥、膿毒癥休克,最終導致患者死亡[4]。對于新冠肺炎危重癥患者的中醫(yī)藥救治,人參的使用頻率在藥物分布中占了56.41%[5]。對于新冠肺炎危重癥患者,人參充分發(fā)揮了“回陽救逆”的作用。人參很早就用于厥脫證(膿毒癥)的治療,《傷寒大全》記載的獨參湯單用一味人參,可治療“氣虛氣脫,脈微欲絕”等癥,曾是中國古代搶救危重癥患者的重要方劑[6]。2015版《中華人民共和國藥典》指出人參具有“大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智 ”之功效,常用于體虛欲脫,肢冷脈微等臨床病癥(包括現(xiàn)代醫(yī)學的膿毒癥休克)[7]。以人參為主成分的參附注射液被國家中醫(yī)藥管理局列為首批“全國中醫(yī)院急診室必備中成藥”,一直應用于膿毒癥休克患者的臨床治療[8]。
人參為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根和根莖[9]。研究表明,人參的有效成分主要為人參皂苷和多糖[10]。人參皂苷和人參多糖具有廣泛的藥理活性,包括抗炎、抗腫瘤、抗病毒和提高機體免疫功能等作用[11-14]。目前,人參抗膿毒癥作用的研究主要集中在人參皂苷單體上,對其發(fā)揮抗膿毒癥效應的物質(zhì)基礎(chǔ)及整體作用機理缺乏系統(tǒng)而深入的研究。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法可以綜合分析人參發(fā)揮抗膿毒癥的效應有效成分,挖掘人參與膿毒癥的共同作用靶點,以分析人參抗膿毒癥靶點所涉及的生物學功能和信號通路[15]。因此,本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法研究人參發(fā)揮抗膿毒癥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制,為新藥研發(fā)及中藥人參的拓展應用提供理論依據(jù)。
在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫及分析平臺(TCMSP)中檢索人參的有效成分,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18[16]兩個關(guān)鍵藥物代謝動力學參數(shù)為篩選條件,以獲得人參的有效成分。使用TCMSP數(shù)據(jù)庫中相關(guān)靶點檢索功能,通過有效成分的MOLID檢索人參有效成分的作用靶點,去除沒有檢索到靶點的有效成分,依次得到17種有效成分對應的作用靶點。運用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)將有效成分的作用靶點進行規(guī)范化處理以便用于后續(xù)研究。
以膿毒癥的英文名“sepsis”作為檢索關(guān)鍵詞,在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www. genecards. org)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)中檢索膿毒癥的潛在靶點[17]。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中,Score值越高則代表該靶點與疾病聯(lián)系越密切。
使用R語言將人參有效成分的作用靶點與膿毒癥相關(guān)靶點取交集并繪制韋恩圖,兩者交集部分即為人參抗膿毒癥的潛在作用靶點,通過Cytoscape3.7.2構(gòu)建人參有效成分-膿毒癥靶點網(wǎng)絡(luò)圖。
將人參有效成分作用靶點與膿毒癥靶點的交集靶點信息提交到STRING11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)用以構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò),在生物種類選項中選擇 “Homo sapiens”,即可得到PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。
運用Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org)對人參有效成分作用靶點與膿毒癥靶點的交集靶點進行富集分析。將上述交集靶點信息導入Metascape數(shù)據(jù)庫中進行GO及KEGG分析,顯著性差異設(shè)置為P<0.01,保存GO及KEGG分析結(jié)果并通過R語言對結(jié)果進行可視化處理。
運用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建人參有效成分-膿毒癥靶點-信號通路的網(wǎng)絡(luò)圖并使用軟件中內(nèi)置分析工具分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)。以連接度(Degree)、介度(Betweenness)及緊密度(Closenesss)等[18]網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)判斷人參發(fā)揮抗膿毒癥作用的核心有效成分及其作用的核心靶點。
在TCMSP數(shù)據(jù)庫中根據(jù)OB和DL參數(shù)篩選初步獲得22個成分,剔除5個未查詢到靶點的成分,最終獲得17個有效成分(見表1)。運用TCMSP靶點預測功能對上述17個成分作用靶點加以預測,預測到人參有效成分作用靶點256個,篩選合并后刪除重復值共得到靶點110個。利用 Cytoscape3.7.2軟件對人參有效成分及其作用靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進行繪制和分析,共獲得127個節(jié)點(包含110個靶點和17個有效成分)與240條關(guān)系,圖中節(jié)點的大小代表相應的Degree值,節(jié)點面積越大代表Degree值越大,表示涉及的生物功能越多,其生物學重要性越高(見圖1)。
使用GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選獲得膿毒癥相關(guān)靶點2 316個。選擇Score值大于中位數(shù)的靶點為膿毒癥的相關(guān)靶點,即在 GeneCards數(shù)據(jù)庫中膿毒癥靶點Score值最大為31.51,最小為0.19,中位數(shù)為2.54,故選擇Score值>2.54的靶點為膿毒癥的相關(guān)靶點[19]。使用OMIM和DrugBank數(shù)據(jù)庫篩選靶點分別得到97個和1個膿毒癥相關(guān)靶點,合并3個數(shù)據(jù)庫后刪除重復值,最終得到1 314個膿毒癥相關(guān)靶點。
表1 人參有效成分
注:圖中綠色代表有效成分作用的靶點;藍色代表17個有效成分。 圖1 人參有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖
應用R語言將人參有效成分和膿毒癥相關(guān)的作用靶點取交集,繪制韋恩圖(見圖2),得到交集靶點43個,即人參有效成分抗膿毒癥作用的潛在靶點。使用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建人參有效成分-膿毒癥靶點網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。網(wǎng)絡(luò)圖中共有57個節(jié)點,86條邊,體現(xiàn)了人參可通過多組分,多靶點協(xié)同抗膿毒癥的特點。網(wǎng)絡(luò)圖中菱形代表抗膿毒癥作用靶點,六邊形表示15種有效成分。15種有效成分中作用靶點較多的6個有效成分為山奈酚(27個)、β-谷甾醇(10個)、人參皂苷rh2(9個)、原阿片堿(8個)、灌木遠志酮 A(7個)、豆甾醇(6個),以及對應有效成分較多的3個靶點為PTGS2(對應11個有效成分)、ADRB2(對應9個有效成分)、CHRNA7(對應4個有效成分)可能為人參抗膿毒癥的關(guān)鍵有效成分和關(guān)鍵作用靶點。
圖2 人參有效成分-膿毒癥靶點韋恩圖
圖3 人參有效成分-膿毒癥靶點網(wǎng)絡(luò)圖
將篩選得到人參成分-膿毒癥43個交集靶點提交到 STRING11.0在線平臺,物種選擇為“人”,交互作用選擇>0.4的靶點即可得到人參靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4)。為了更加清楚體現(xiàn)核心蛋白在PPI中的調(diào)控作用,使用 Cytoscape3.7.2軟件中內(nèi)置的Network Analyzer工具進行網(wǎng)絡(luò)可視化處理得到可視化PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖5)。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共有43個節(jié)點,320條邊,平均節(jié)點度為14.88,平均局部聚類系數(shù)為0.65。網(wǎng)絡(luò)圖中連接度值通過節(jié)點的大小和顏色表示,節(jié)點越大,顏色越深(由淺黃到橙色),表示靶點連接度值越大,反之表示連接度值越小,由圖5可以看出,AKT1、TNF、CASP3、MAPK8、IL1B、PTGS2、JUN、ICAM1、NOS3、VCAM1、PPARG等靶點在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了較為關(guān)鍵的調(diào)控作用。
圖4 人參-膿毒癥靶點PPI網(wǎng)絡(luò)(STRING11.0)
圖5 人參-膿毒癥靶點PPI網(wǎng)絡(luò)
利用Metascape平臺,將人參有效成分作用靶點與膿毒癥靶點的交集靶點進行GO的生物過程(Biological Process, BP)、細胞組分(Cell Component, CC) 和分子功能(Molecular Function, MF)富集分析,選擇P<0.01的項目進行篩選,總共富集到1 064條生物過程,其中65項與分子功能相關(guān),25項與細胞組分相關(guān)。GO分析結(jié)果按照富集的顯著性差異取排名前10的項目使用R語言繪制柱狀圖(見圖6)。KEGG通路分析按P<0.01進行篩選,總共富集到102條信號通路,篩選排名前20通路進行氣泡圖繪制(見圖7)。
注:A為生物過程富集分析;B為分子功能富集分析;C為細胞組分富集分析。圖6 GO分析
使用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建人參有效成分-膿毒癥靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖(見圖8)。通過該軟件內(nèi)置的分析工具分析人參抗膿毒癥效應的網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù),得到核心成分及核心作用靶點。人參治療膿毒癥的核心有效成分為山奈酚、人參皂苷rh2、β-谷甾醇和灌木遠志酮 A等(見表2)。人參治療膿毒癥的最主要靶點為TNF、RELA、JUN、MAPK8、PTGS2、IL1B、AKT1、CASP3、NFKBIA和TGFB1等(見表3)。
圖7 KEGG通路富集分析
注:橙色圓形節(jié)點為人參的有效成分,淺綠色矩形為有效成分作用靶點,淺藍色倒三角為有效成分作用的信號通路;節(jié)點的面積大小和顏色深淺代表其度數(shù),面積越大、顏色越深說明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的作用越重要。圖8 人參有效成分-膿毒癥靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖
表2 人參有效成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)
表3 人參有效成分靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)
中藥在治療疾病時具有多組分、多靶點、多途徑、系統(tǒng)調(diào)控及協(xié)同作用的特點[20]。由于中藥復雜的物質(zhì)組分導致其作用機制難以闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學可以從藥物、靶點、疾病三者之間相互作用的系統(tǒng)性出發(fā),以復雜的網(wǎng)絡(luò)模型分析中藥的藥理學性質(zhì),闡明中藥成分-靶點-疾病復雜的相互作用關(guān)系,為中藥多成分作用機制研究及中藥現(xiàn)代化應用提供依據(jù)[21]。
本研究表明,人參中多種有效成分可以通過多靶點,多信號通路發(fā)揮抗膿毒癥的效應。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法篩選得到人參抗膿毒癥效應的核心有效成分為山奈酚、人參皂苷rh2、β-谷甾醇、灌木遠志酮A、豆甾醇、原阿片堿等。山奈酚(Kaempferol)主要是來源于姜科植物山奈(KaempferiagalangalL.)根莖的黃酮類化合物,廣泛存在于各種水果和蔬菜[22]。研究表明, 山奈酚具有較強的抗氧化、抗炎藥理活性[23-24]。山奈酚對盲腸結(jié)扎穿刺所致小鼠肺損傷具有明顯的保護作用,提示其具有抗膿毒癥的潛力[25]。人參皂苷rh2具有很強的抗炎活性,其可通過抑制NF-κB的活化進而顯著抑制RAW264.7巨噬細胞炎癥因子的釋放[26]。同時,人參皂苷rh2對脂多糖(LPS)誘導的小鼠急性肺損傷具有明顯的保護作用[27]。豆甾醇和β-谷甾醇均屬于天然植物甾醇類化合物,兩者藥理活性較為相似[28-29],具有抗氧化、抗炎等藥理活性[30-31]。灌木遠志酮 A和原阿片堿未見詳細抗炎報道。本研究通過PPI蛋白互作分析,得到PPI核心基因AKT1、TNF、CASP3、MAPK8、IL1B、PTGS2、JUN、ICAM1、NOS3、VCAM1、PPARG,上述基因靶點在人參抗膿毒癥中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
運用GO生物學功能分析和KEGG通路富集以明確人參有效成分作用靶點-膿毒癥靶點的43個交集靶點在生物學功能和信號通路中的調(diào)控作用。GO分析表明上述交集基因主要通過影響對脂多糖的反應、對細菌起源分子的反應、對有毒物質(zhì)的反應、對細胞外刺激的反應、細胞因子介導的信號通路等過程而發(fā)揮抗膿毒癥的作用。KEGG富集結(jié)果顯示,人參發(fā)揮抗膿毒癥效應的靶點主要富集的通路涉及TNF、NF-κB、Toll樣受體、IL-17以及Th17細胞分化等信號通路。這些通路都與膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究表明,腫瘤壞死因子(TNF)是膿毒癥和休克(由循環(huán)和/或代謝異常引起的危及生命的疾病)炎癥反應的主要介質(zhì)。同時,注射外源性腫瘤壞死因子會導致一種與感染性休克難以區(qū)分的綜合征,而向人類體內(nèi)注射腫瘤壞死因子則會導致全身炎癥反應綜合征(SIRS)[32]。Toll樣受體(TLR)家族是哺乳動物中最具有特征性的模式識別受體,其中TLR4是革蘭氏陰性菌脂多糖的特異性受體,在膿毒癥發(fā)病機制中扮演關(guān)鍵角色[33]。在膿毒癥發(fā)生過程中,NF-κB信號通路激活后可引起TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放進而損傷組織,過度釋放的炎癥因子再次刺激NF-κB的激活使得炎癥因子進一步釋放形成炎癥風暴,加重病情[34]。Th17細胞是初始免疫與獲得性免疫之間的重要橋梁,可在感染發(fā)生時誘導其他輔助性T細胞發(fā)揮作用[35]。膿毒癥患者外周血Th17細胞表達增加,同時膿毒癥急性肺損傷和腎損傷患者外周血Th17細胞表達亦顯著增加,提示Th17細胞分化通路在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[36-38]。
綜上所述,人參及其有效成分可通過對物質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導、炎癥反應等多靶點及多通路的調(diào)節(jié)而發(fā)揮抗膿毒癥的效應,為人參抗膿毒癥的臨床應用和科學研究提供重要參考。