白新偉，陳文輝

(六盤水師范學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州六盤水 553004)

脂肪胺是一類毒性較大且反應(yīng)活性較高的有機(jī)胺類，廣泛存在于自然界中。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸以及其他含氮類有機(jī)化合物都能夠通過生物降解轉(zhuǎn)化為脂肪胺。水產(chǎn)品在冷藏期間，也能在酶及微生物作用下從魚類肌肉組織中分解成脂肪胺[1]。脂肪胺類化合物具有毒性以及潛在的致癌性[2 - 4]，因此,如何有效地檢測冷凍海產(chǎn)品中脂肪胺已經(jīng)成為一個(gè)重要研究課題。 目前對(duì)脂肪胺化合物分離分析最常用的方法是高效液相色譜法[5 - 7]，但色譜柱價(jià)格昂貴，有機(jī)溶劑消耗量大，分析時(shí)間長等缺點(diǎn)限制了該方法對(duì)脂肪胺化合物分離檢測的應(yīng)用。

毛細(xì)管電泳是[8 - 12]一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù),在脂肪胺類化合物的分離檢測領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。但小分子脂肪胺大多無紫外吸收或紫外吸收較弱，所以一般采用毛細(xì)管電泳-間接紫外檢測方法[8]，但存在靈敏度低和線性范圍窄及背景吸收不穩(wěn)定或基線漂移嚴(yán)重，難以保證峰形對(duì)稱等諸多缺點(diǎn)。為克服以上方法存在的缺陷，采用柱前或柱后衍生化是一種行之有效的手段，所以尋找合適的脂肪胺衍生試劑一直是制約毛細(xì)管電泳法測定脂肪胺的關(guān)鍵和難點(diǎn) 。本實(shí)驗(yàn)以10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)作為柱前衍生試劑，獲得的衍生物性質(zhì)穩(wěn)定，分離度效果好，檢測靈敏度高。脂肪胺化合物標(biāo)準(zhǔn)品定性定量檢測及實(shí)際冷凍鲅魚樣品的測定實(shí)驗(yàn)使毛細(xì)管電泳技術(shù)高效、快速等優(yōu)勢(shì)都得以充分的體現(xiàn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

HP-3D毛細(xì)管電泳儀(美國，Agilent公司)；熔融毛細(xì)管總長58.5 cm×50 μm i.d.，有效長度為50 cm。

脂肪胺標(biāo)準(zhǔn)品：甲胺、 二甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、庚胺、辛胺(昆明聚星達(dá)化學(xué)試劑有限公司公司)；衍生試劑：10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)(河北建新化工股份有限公司)；乙腈(色譜純)(山東旭晨化工科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制、衍生化及樣品預(yù)處理

脂肪胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液：準(zhǔn)確稱取脂肪胺標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純乙腈配成1.0×10-5mol/L。衍生試劑EASC溶液(1.0×10-3mol/L)：準(zhǔn)確稱取8.1 mg EASC，溶于25 mL 無水乙腈。

標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化:向安瓿瓶中加入20 μL脂肪胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，80 μL EASC溶液，60 ℃水浴中反應(yīng)3 min，稀釋2倍后，進(jìn)樣10 μL分析。

實(shí)際樣品預(yù)處理：參照文獻(xiàn)方法[5]，冷凍鲅魚融化后取可食用部分剁碎，準(zhǔn)確稱取 1.0 g 樣品，加入3 mL 10% 三氯乙酸，冰浴條件下于乳缽中充分研磨勻漿并定容至 5 mL，然后以 1 500 r/min 離心 3 min。取上清液加冰乙酸中和后，即為待測樣液，待用。

1.3 毛細(xì)管電泳條件

背景電解質(zhì)為含15 mmol/L SDS的20 mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH為9.2)。采用壓力進(jìn)樣的方式：50 mbar×8 s。分離電壓18 kV，柱溫25 ℃，檢測波長為 219 nm。衍生后的標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液及背景電解質(zhì)溶液進(jìn)樣前均用0.45 μm微孔濾膜過濾，再用超聲波脫氣10 min。每次進(jìn)樣前依次用0.1 mol/L NaOH溶液、超純水和背景電解質(zhì)溶液各沖洗毛細(xì)管2 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)表明，10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯對(duì)10種脂肪胺的衍生化產(chǎn)率隨反應(yīng)溫度、衍生試劑用量不同而存在差異。衍生產(chǎn)率隨反應(yīng)溫度升高，產(chǎn)率明顯增大。當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，衍生反應(yīng)3 min后產(chǎn)物信號(hào)強(qiáng)度基本穩(wěn)定，繼續(xù)升高溫度會(huì)引起衍生試劑輕度分解而影響衍生產(chǎn)率。衍生試劑的摩爾量為與樣品摩爾比為4時(shí)衍生產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)。衍生產(chǎn)物在室溫下保存，數(shù)周內(nèi)色譜峰高皆無明顯變化，說明衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性較好。

2.2 分離條件的優(yōu)化

調(diào)整硼酸鹽的濃度為10～30 mmol/L(pH 值為9.0)，對(duì)10 種脂肪胺衍生物混合標(biāo)樣進(jìn)行分析。硼酸鹽濃度低于15 mmol/L時(shí)，所有衍生物的信號(hào)峰較弱。硼酸鹽濃度為20 mmol/L，分離效果好。繼續(xù)增加硼酸鹽濃度，分離效果無明顯改善，以丁胺、戊胺、己胺、庚胺為例，如圖1。所以確定硼酸鹽濃度為20 mmol/L。

采用硼酸鹽溶液(20 mmol/L)，調(diào)節(jié)其pH 值為9.0～9.4，分析混合標(biāo)樣。由圖2可知隨著pH[12]增加分析物之間分離度明顯改善，直至為9.2。進(jìn)一步提高pH值，分離效率呈下降趨勢(shì)，選擇緩沖溶液pH為 9.2。

圖1 硼酸鹽濃度對(duì)脂肪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液分離的影響Fig.1 Influence of borate on separation of fatty amines

圖2 pH對(duì)脂肪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液分離的影響Fig.2 Influence of pH on separation of fatty amines

圖3 SDS對(duì)脂肪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液分離的影響Fig.3 Influence of SDS on separation of fatty amines

表面活性劑[13,14]具有改善電滲流，提高分離效果的作用，本實(shí)驗(yàn)加入表面活性劑SDS，出峰時(shí)間減少，峰形得到改善，如圖3所示。但是高濃度的SDS導(dǎo)致基線噪音增加，綜合比較選擇SDS濃度為15 mmol/L。

最終確定最優(yōu)分離條件為：20 mmol/L硼酸鹽緩沖溶液(SDS濃度為15 mmol/L，pH為9.2)作為背景電解質(zhì)，柱溫25 ℃，分離電壓18 kV。

2.3 線性范圍、檢出限和重現(xiàn)性

配制系列衍生化的10種脂肪胺，由高濃度到低濃度依次進(jìn)樣分析，依據(jù)峰面積對(duì)其濃度的變化進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表1。在上述最優(yōu)化條件下進(jìn)行遷移時(shí)間與峰面積重現(xiàn)性考察，通過5次進(jìn)樣實(shí)驗(yàn)，遷移時(shí)間、峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在0.99%～1.65%和0.86%～1.89%之間，見表1。本文方法檢出限明顯低于謝娟[5]報(bào)道的高效液相色譜法測定水產(chǎn)品和水發(fā)食品中 4 種脂肪胺檢出限。

2.4 實(shí)際樣品分析

取實(shí)際樣品3份，一份按“1.2”方法衍生化，直接進(jìn)行定性定量分析，典型電泳譜圖見圖4，各組分含量見表2；另兩份用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，考察方法精密度，見表2。

表1 10種脂肪胺的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及遷移時(shí)間、峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)

圖4 標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)和冷凍鲅魚樣品溶液(b)電泳譜圖Fig.4 Electropherograms of standard solution(a) and sample solutions of frozen mackerel(b)R.EASC;1.methylamine;2.dimethylamine;3.ethylamine;4.diethylamine;5.propylamine;6.butyl amine;7.pentylamine;8.acetamine;9.heptamine;10.octylamine.

表2 冷凍鲅魚中脂肪胺含量及回收率

(續(xù)表2)

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)利用10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)對(duì)10種脂肪胺類化合物進(jìn)行衍生化，在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了分析物的高效基線分離及檢測。建立的方法線性范圍寬、重現(xiàn)性好、操作簡便、干擾小，是一種適用于冷凍水產(chǎn)品中脂肪胺的定性定量快速檢測方法。