張 靜，高玉時(shí)，周 倩，馬麗娜，陸俊賢，唐修君，萬 玉，楊星星，趙 敏

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225125)

硝基咪唑類藥物(Nitromidazoles，NMZs)是一類具有5-硝基取代咪唑雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，主要包括甲硝唑(Metronidazole，MNZ)、二甲硝唑(Dimetridazole，DMZ)、洛硝噠唑(Ronidazole，RNZ)、塞克硝唑(Secnidazole，SNZ)、異丙硝唑(Ipronidazole，IPZ)和奧硝唑(Ornidazole，ORN)等。因該類藥物具有抗菌和抗原蟲作用且療效快，曾廣泛用于殺滅及預(yù)防厭氧菌和病原蟲，同時(shí)它們還有促生長和提高飼料利用率[1]的作用。研究發(fā)現(xiàn)，硝基咪唑類藥物具有動(dòng)物致癌性和細(xì)胞誘變毒性，歐盟、美國和日本已禁止在食源性動(dòng)物中使用[2]；我國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 31650-2019)明確規(guī)定MNZ和DMZ允許作治療用，但在動(dòng)物源性食品中不得檢出。硝基咪唑類藥物代謝迅速，主要是咪唑環(huán)上的取代基甲基被氧化成羥甲基，MNZ形成羥基甲硝唑(Metronidzole-OH，MNZOH)，DMZ和RNZ都代謝成羥基二甲硝咪唑(2-Hydroxymethyl-1-methyl-5-nitroimidazole，HMMNI)，IPZ代謝成羥基異丙硝唑(Ipronidazole-OH，IPZOH)[3]。有研究表明硝基咪唑類代謝產(chǎn)物在動(dòng)物體內(nèi)的維持時(shí)間比原藥長，并且具有和原藥類似的毒性[4]。目前獸醫(yī)中常用的有MNZ、RNZ和DMZ，但SNZ、ORN、TNZ和IPZ是繼上述三種之后療效更高，耐受性更好，不良反應(yīng)較少的藥物。但未見各國對這5種藥物在動(dòng)物組織中使用和殘留量作出規(guī)定，其實(shí)際應(yīng)用中它們有可能替代MNZ和DMZ等應(yīng)用于臨床獸醫(yī)，且它們也具有硝基咪唑類藥物的毒副作用。所以建立這7種硝基咪唑類藥物及其相應(yīng)的3種代謝物殘留的檢測方法對食品安全監(jiān)管是完全有必要的。

目前用于硝基咪唑類藥物及其代謝物的研究方法主要有液相色譜法(HPLC)[5,6]、氣相色譜法(GC/MS)[7 - 9]、毛細(xì)管電泳法[10,11]和液相色譜-質(zhì)譜法(LC/MS)[12 - 18]。本文采用同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法，利用乙酸乙酯提取，SCX固相萃取柱凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)同時(shí)測定雞肉和雞蛋中10種硝基咪唑類藥物及代謝物。方法簡單，靈敏度高，特異性強(qiáng)，回收率高，能夠滿足日常檢測和監(jiān)督的需求。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ MAX型液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國，塞默飛公司)；固相萃取裝置(美國，Supelco公司)；N-EVAP 112氮吹儀(美國，Organomation公司)。SCX固相萃取柱(500 mg/6mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：甲硝唑(MNZ)、地美硝唑(DMZ)、洛硝噠唑(RNZ)、奧硝唑(ORN)、塞克硝唑(SNZ)、羥基甲硝唑(MNZOH)、羥基二甲硝咪唑(HMMNI)、異丙硝唑(IPZ)、羥基異丙硝唑(IPZOH)、甲硝唑-D4(MNZ-D4)、地美硝唑-D3(DMZ-D3)、洛硝噠唑-D3(RNZ-D3)、奧硝唑-D3(ORN-D3)、塞克硝唑-D6(SNZ-D6)、羥基甲硝唑-D2(MNZOH-D2)、羥基二甲硝咪唑-D3(HMMNI-D3)、異丙硝唑-D3(IPZ-D3)、羥基異丙硝唑-D3(IPZOH-D3)，均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度均≥98%。標(biāo)準(zhǔn)品溶液：分別準(zhǔn)確稱取適量MNZ、DMZ、RNZ、ORN、SNZ、IPZ、IPZOH、MNZOH和HMMNI(精確到0.01 mg)，用甲醇溶解，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃保存；內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別準(zhǔn)確稱取適量MNZ-D4、DMZ-D3、RNZ-D3、ORN-D3、SNZ-D6、IPZ-D3、IPZOH-D3、MNZOH-D2和HMMNI-D3(精確到0.01mg)，用甲醇溶解，配制成濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃保存。乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯(色譜純，德國Merck公司)；其他試劑均為分析純。水為Milli-Q系統(tǒng)制備的超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 樣品的制備

空白樣品為經(jīng)檢驗(yàn)不含上述硝基咪唑類化合物，攪碎使均勻，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)際樣品來源于超市、養(yǎng)殖場和農(nóng)貿(mào)市場。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品2 g(精確到0.01 g)，加入100 μL 100 ng/mL硝基咪唑混合內(nèi)標(biāo)工作溶液，采用10 mL乙酸乙酯提取，渦旋混勻，振蕩10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液。重復(fù)提取一次，合并上清液。上清液中加入5 mL乙睛飽和的正己烷，渦旋混勻后振蕩10 min，5 000 r/min離心5 min后，棄去正己烷。40 ℃氮?dú)鉂饪s儀吹干。加入5 mL乙酸-乙酸乙酯(5+95)混勻后備用。

凈化采用SCX固相萃取柱，5 mL乙酸-乙酸乙酯(5+95)活化，將提取液全部過柱，分別用2.5 mL丙酮，5 mL甲醇，5 mL乙睛淋洗。真空抽干，5 mL氨水-乙睛(5+95)洗脫后，45 ℃氮?dú)鉂饪s儀吹干，準(zhǔn)確加入1.0 mL 0.1%甲酸溶液-乙睛(體積比9∶1)溶解殘?jiān)?，過0.45 μm膜，備用。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：Waters C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸甲醇溶液。梯度洗脫條件為：0～1.0 min，90%A；1.0～5.0 min，90～10%A；5.0～6.0 min，10%A；6.0～6.1 min，10%～90%A；6.1～8.0 min，90%A。柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源，正離子掃描(ESI+)；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；離子源溫度：350 ℃；電噴霧電壓：3 500 V；霧化氣壓力：35 Arb；輔助氣壓力：10 Arb；離子傳輸管溫度：350 ℃；碰撞氣：氬氣。目標(biāo)分析物的定性定量離子對、碰撞電壓、離子透鏡電壓等信息見表1。

表1 硝基咪唑類藥物的信息及質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化條件

(續(xù)表1)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件和色譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣的方式將500 ng/mL的10種硝基咪唑類化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及對應(yīng)的氘代內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到離子源中，在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，通過優(yōu)化離子透鏡電壓得到最佳強(qiáng)度的各待測目標(biāo)物的分子離子峰。以確定的分子離子峰為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜碎片離子掃描，獲得碎片離子信息，得到二級質(zhì)譜圖。選取豐度高的為定量離子，另一種化合物為定性離子。內(nèi)標(biāo)化合物選取豐度高的為定性離子，不需定量離子。

2.2 樣品前處理方法的選擇

2.2.1 提取溶劑的選擇硝基咪唑類化合物的提取溶劑一般為乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇等單一溶劑或混合溶劑。本文比較了乙腈、甲醇、二氯甲烷-乙腈(1∶1，V/V)和乙酸乙酯等溶劑的提取效率，結(jié)果見圖1。由圖可以看出，提取溶劑對MNZOH和HMMNI的回收率影響最大，乙酸乙酯提取效率最高，分別為98.1%和80.5%。提取溶劑對其他化合物的影響不是很大，且采用乙酸乙酯提取可去除大部分親水性雜質(zhì)，降低后續(xù)凈化的難度，因此選用乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.2.2 固相萃取柱的優(yōu)化本文比較了C18、HLB和SCX三種固相萃取柱對硝基咪唑化合物回收率的影響。由圖2可以看出，C18和HLB小柱對9種硝基咪唑化合物的回收率均偏低，而SCX小柱對目標(biāo)化合物的回收率均在70%～115%之間，因此選用SCX固相萃取柱凈化。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)(ME)評價(jià)

本研究按(空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1)×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(ME)(表2)。當(dāng)ME為負(fù)值時(shí)表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME為正值時(shí)表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；絕對值越大基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)。由表2可知，硝基咪唑類藥物及其代謝物在各基質(zhì)溶液中呈現(xiàn)一定的基質(zhì)抑制作用，其中MNZOH和HMMNI基質(zhì)抑制效應(yīng)較大。經(jīng)過本方法凈化處理后目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)均可在接受范圍內(nèi)，且本文采用內(nèi)標(biāo)法測定實(shí)際樣品也可在一定程度上補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的影響。

圖1 提取溶劑對硝基咪唑化合物回收率的影響Fig.1 Effects of extraction solvents on the recoveries of the NIMs

圖2 不同固相萃取柱對硝基咪唑化合物回收率的影響Fig.2 Effects of SPE cartridges on the recoveries of the NIMs

表2 不同基質(zhì)中硝基咪唑類藥物及其代謝基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

2.4 線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

取一系列硝基咪唑類的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定的色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定。以外標(biāo)內(nèi)標(biāo)峰面積之比Y和對應(yīng)的質(zhì)量濃度X(ng/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在0.5～40.0 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3。在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按信噪比(S/N)等于10和3計(jì)算，本方法的定量限和檢測限見表3。

表3 硝基咪唑藥物線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢測限(LOD)和定量限(LOQ)

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

在空白組織中添加1.0、2.0、10.0 μg/kg水平的目標(biāo)分析物，每個(gè)樣品按上述方法重復(fù)測定6次，求日內(nèi)精密度(RSD)；再每天測定一次，連續(xù)測定6天，求日間RSD，結(jié)果見表4。結(jié)果表明日內(nèi)加標(biāo)回收率在73.8%～112%之間，RSD為3.21%～11.8%；日間加標(biāo)回收率在70.5%～106%之間，RSD為4.67%～14.6%。準(zhǔn)確度和精密度能滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[19]的要求。

2.6 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本法測定了當(dāng)?shù)丶爸苓叺貐^(qū)市場雞肉、雞蛋等60批次樣品，雞肉中無檢出；雞蛋有2份檢出MNZ、DMZ、TNZ和MNZOH，含量分別為5.7 μg/kg、3.7～423.5 μg/kg、5.2 μg/kg和3.2 μg/kg。其余樣品未檢出上述硝基咪唑類藥物。說明在雞養(yǎng)殖過程中，硝基咪唑類藥物存在著一定的使用率。

表4 方法的加標(biāo)回收率和精密度

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定雞肉和雞蛋中7種硝基咪唑類藥物及其對應(yīng)的3種羥基代謝物殘留。硝基咪唑類化合物及代謝物在0.5～40 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，方法的檢測限0.5～1.0 μg/kg。該方法簡單、準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好、靈敏度高，且方法的回收率、靈敏度和定量限均能滿足目前日常監(jiān)控和檢測的要求。