張煜敏， 張楨燁， 錢玲玲， 王寧， 繆凌峰， 王如興

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院心內(nèi)科， 江蘇 無錫 214023)

糖尿病是人類健康的主要威脅之一，國際糖尿病聯(lián)合會(huì)的數(shù)據(jù)顯示，每11個(gè)成年人(20～79周歲)中就有1人罹患糖尿病。2019年國際糖尿病聯(lián)盟公布全球糖尿病患者為4.63億，我國高達(dá)1.16億，居世界第一[1]。糖尿病心臟病變是糖尿病晚期的主要致死原因之一[2]，其病理表現(xiàn)主要為心肌細(xì)胞凋亡、肥厚和心肌間質(zhì)纖維化并最終導(dǎo)致心力衰竭，其中心肌細(xì)胞凋亡是其主要病理改變之一[3]。因此，尋找有效的藥物緩解糖尿病心肌細(xì)胞凋亡，有助于改善糖尿病患者的預(yù)后，延緩糖尿病患者的心血管并發(fā)癥發(fā)生，降低糖尿病患者的死亡率。

槲皮素是人體日常攝入最多的一種黃酮類化合物，普遍存在于蘋果、茶葉、洋蔥、藍(lán)莓等人類日常膳食之中[4]，具有抗炎癥、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、改善糖尿病、舒張血管等多種生物學(xué)效應(yīng)。槲皮素可能是改善糖尿病及其心血管并發(fā)癥的潛在藥物[5]，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不完全清楚。

蛋白激酶B(AKT)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它能夠使叉頭核蛋白O3(FOXO3)蛋白在T32位置磷酸化而使FOXO3輸出增加，從而抑制其轉(zhuǎn)錄功能[6]。在糖尿病情況下，AKT的活性被抑制，從而加重了FOXO3相關(guān)的細(xì)胞凋亡[7]。槲皮素不僅能夠減少糖尿病時(shí)的氧化應(yīng)激損傷，并且能夠通過磷酸化上調(diào)AKT的活性[8]，從而抑制糖尿病時(shí)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究主要探討不同濃度的槲皮素通過激活A(yù)KT從而抑制FOXO3對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制，為糖尿病心臟病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Mini-PROTEAN Tetra垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)；PCR擴(kuò)增儀、Minispin高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；7500HT 熒光定量 PCR 儀(美國 ABI 公司)；Allegra 46R型高速低溫離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)；共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；Nanodrop、BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)。 pAKT，AKT，pFOXO3，F(xiàn)OXO3，BAX，BCL-2，GAPDH抗體均為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；山羊抗兔(中杉金橋公司)；槲皮素、鏈脲佐菌素(STZ)、DMSO、DAPI染液(美國Sigma公司)；TBST(康為世紀(jì)公司)；原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(美國Roche公司)；Quantinova SYBR Green PCR 試劑盒(德國Qiagen公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；2%異氟醚(瑞沃德公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠來源于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重(180±10)g，于清潔級(jí)別環(huán)境下飼養(yǎng)，給予12 h交替明暗周期，充足的飼料與水。

1.3 糖尿病大鼠及槲皮素干預(yù)模型的建立與分組

參照本課題組以往研究報(bào)道的造模方法建立1型糖尿病大鼠模型[9]，將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組各10只，即對(duì)照組、糖尿病組、槲皮素低劑量(50 mg/kg)干預(yù)組和槲皮素高劑量(100 mg/kg)干預(yù)組。糖尿病模型大鼠腹腔注射STZ 60 mg/kg，1周后尾靜脈采血測血糖，血糖大于16.7 mmol/L判定為糖尿病成模。糖尿病大鼠成模后，每日配置槲皮素溶解于DMSO中，50和100 mg/kg灌胃給藥，1個(gè)月后2%異氟醚麻醉測定各項(xiàng)生理數(shù)值后取心肌組織標(biāo)本。

1.4 大鼠心功能測定

槲皮素灌胃1個(gè)月后，每組隨機(jī)取大鼠5只，用2%異氟醚麻醉后，應(yīng)用飛利浦IE33心臟彩超儀在乳頭肌水平測定心功能指標(biāo)： 左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(FS)、左心室內(nèi)徑(LVID)、左心室收縮末期容積(LVESV)。

1.5 TUNEL染色法檢測大鼠心肌凋亡水平

大鼠心臟先經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，脫水后包埋，切成5 μm的組織切片。將心肌組織切片用4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗3遍，加入通透液通透10 min，PBS清洗3遍，加入TUNEL反應(yīng)混合物室溫避光孵育1 h，PBS清洗3遍，滴上DAPI染液，共聚焦顯微鏡觀察大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡水平。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大鼠心肌組織Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)

提取心肌組織RNA，測定RNA濃度，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。設(shè)計(jì)引物如下，β-肌動(dòng)蛋白上游：5′-AGATTACTGCCCTGGCTCCTAG-3′，下游：5′-CCTGCTTGCTGATCCACATCT-3′;Bax上游：5′-GAACCATCATGGGCTGGACA-3′，下游：5′-GTGAGTGAGGCAGTGAGGAC-3′;Bcl-2上游：5′-GAACTGGGGGAGATTGTGG-3′，下游：5′-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′。

1.7 蛋白質(zhì)印跡檢測大鼠心肌組織BAX、BCL-2、pAKT、AKT、pFOXO3和FOXO3蛋白表達(dá)

提取心肌組織蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，以每孔35 μg總蛋白量上樣，行10%SDS-PAGE，濃縮膠70 V 40 min，分離膠100 V 60 min，100 V 100 min轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%牛奶封閉2 h，TBST緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20，pH 值 7.5)清洗3遍，一抗1 ∶1 000孵育過夜。次日，TBST清洗3遍，二抗1 ∶3 000孵育1 h，TBST清洗3遍后，ECL顯色系統(tǒng)發(fā)光顯色，并用Image J軟件(德國 Rawak Software公司)進(jìn)行灰度值測定。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 建模后大鼠的基本情況

槲皮素灌胃1個(gè)月后糖尿病組大鼠體重明顯低于對(duì)照組(t=12.14，P<0.05)，槲皮素低劑量干預(yù)組與糖尿病組體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.30,P>0.05)，槲皮素高劑量干預(yù)組的體重明顯高于糖尿病組(t=4.88，P<0.05)；糖尿病組的心臟重量明顯低于對(duì)照組(t=7.805，P<0.05)，其余各組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 槲皮素對(duì)糖尿病大鼠心功能的影響

槲皮素灌胃1個(gè)月后，糖尿病組LVEF及FS均明顯低于對(duì)照組(t值分別為12.56和11.62，P<0.05), 槲皮素低劑量干預(yù)組和高劑量干預(yù)組的LVEF均明顯高于糖尿病組(t值分別為4.70和8.36，P<0.05)，槲皮素低劑量干預(yù)組和高劑量干預(yù)組的FS均明顯高于糖尿病組(t值分別為3.63和6.70，P<0.05)。糖尿病組的LVID明顯高于對(duì)照組(t=3.31，P<0.05)。糖尿病組的LVESV明顯高于對(duì)照組(t=3.54，P<0.05)，槲皮素高劑量干預(yù)組比糖尿病組明顯降低(t=5.77，P<0.05)。見表1。

2.3 槲皮素干預(yù)后糖尿病大鼠心肌細(xì)胞的凋亡水平

TUNEL染色結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(t=11.20，P<0.05)，槲皮素低劑量干預(yù)組與槲皮素高劑量干預(yù)組凋亡率均明顯低于糖尿病組(t分別為5.88和8.96，P均<0.05)，槲皮素低劑量干預(yù)組和高劑量干預(yù)組間凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

2.4 槲皮素干預(yù)后糖尿病大鼠心肌組織Bax、Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)

糖尿病組的BaxmRNA及蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(t值分別為 7.71和7.24，P<0.05)，槲皮素干預(yù)后較糖尿病組明顯降低(P均<0.05)；糖尿病組的Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組(t值為10.65和11.73，P<0.05)，槲皮素干預(yù)后較糖尿病組明顯升高(P均<0.05)。見圖2。

A：大鼠心肌組織Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)；B、C：各組大鼠心肌組織BAX、BCL-2蛋白表達(dá)；*：P<0.05，與對(duì)照組相比；#：P<0.05，與糖尿病組相比圖2 槲皮素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織Bax、Bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)的影響(n=4)

2.5 槲皮素干預(yù)后糖尿病大鼠心肌AKT、FOXO3蛋白及磷酸化水平

糖尿病組的pAKT的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(t=9.19，P<0.05)，槲皮素低劑量干預(yù)組與高劑量干預(yù)組的 pAKT的表達(dá)明顯高于糖尿病組(t值分別為3.25和4.17，P均<0.05); AKT表達(dá)在4組之間無明顯差異；糖尿病組的pFOXO3表達(dá)明顯低于對(duì)照組(t=7.71，P<0.05)，槲皮素低劑量干預(yù)組和高劑量干預(yù)組的pFOXO3表達(dá)明顯高于糖尿病組(t值分別為3.60和3.50，P<0.05)。見圖3。

3 討論

研究表明，多種機(jī)制參與了糖尿病時(shí)心臟收縮及舒張功能的變化，其中包括心肌能量代謝、心臟結(jié)構(gòu)和功能異常等機(jī)制[10]。本研究首先建立STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠模型，期間不僅觀察到糖尿病特征性的多飲多食和體重減輕，而且觀察到明顯的心功能改變包括舒張和收縮功能的下降，提示糖尿病時(shí)大鼠心功能受損。糖尿病時(shí)的心肌細(xì)胞病理改變是糖尿病心臟病變的主要特征，它促成了心衰時(shí)心功能的持續(xù)性下降[11]。在心肌梗死、缺血再灌注和糖尿病心肌病等病理狀態(tài)下都可以觀察到心肌細(xì)胞凋亡[12-13]。糖尿病時(shí)血糖升高，氧化應(yīng)激增多，心肌細(xì)胞也發(fā)生了諸多病理改變[14]。本研究TUNEL染色結(jié)果表明糖尿病時(shí)期心肌細(xì)胞凋亡明顯增多。

多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素能夠緩解糖尿病及其并發(fā)癥[15-16]。本實(shí)驗(yàn)中槲皮素灌胃給藥后糖尿病大鼠的心功能有所改善，心肌細(xì)胞的凋亡減少，但槲皮素對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用的劑量依賴性不顯著。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示糖尿病時(shí)BAX蛋白表達(dá)明顯增高，在喂養(yǎng)槲皮素之后BAX蛋白表達(dá)水平明顯下降；而另一凋亡抑制蛋白BCL-2在糖尿病時(shí)明顯下降，槲皮素干預(yù)后表達(dá)明顯上升。結(jié)果提示槲皮素有對(duì)抗糖尿病時(shí)心肌細(xì)胞凋亡的作用。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，Bax與Bcl-2的mRNA表達(dá)變化與蛋白一致。這證明了槲皮素能夠在基因水平上改善心肌細(xì)胞的凋亡。這一潛在機(jī)制可能與AKT/FOXO3信號(hào)通路有關(guān)，AKT是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡中的重要一環(huán)，而FOXO3作為AKT的下游，與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[17]。本研究觀察到pAKT蛋白的表達(dá)在糖尿病時(shí)期有所下降，槲皮素干預(yù)后pAKT蛋白的表達(dá)明顯上升。而FOXO3在槲皮素干預(yù)之后也明顯改善，提示槲皮素對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用可能與上調(diào)AKT/FOXO3通路有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果表明槲皮素通過激活A(yù)KT/FOXO3信號(hào)通路減少糖尿病心肌細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)糖尿病心肌細(xì)胞，改善心功能。槲皮素可能是治療糖尿病心臟病變的新型潛在藥物。