安仙園 ,袁丹丹 ,徐憶秋 ,沈國(guó)榮

(1. 華東療養(yǎng)院檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫 214065； 2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫 214002； 3. 蘇州大學(xué)附屬蘇州九院檢驗(yàn)科，江蘇 蘇州 215200)

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)分為肝細(xì)胞癌、膽管癌以及混合癌。甲胎蛋白(AFP)是肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物，39%～65%的肝細(xì)胞癌患者血漿AFP升高[1]。糖類抗原12-5(CA12-5)、糖類抗原19-9(CA19-9)和癌胚抗原(CEA)作為胃腸道惡性腫瘤診斷的指標(biāo)，可為膽管癌的診斷提供部分依據(jù)[2-4]。雖然如此，PHC診斷到目前為止仍然沒有特異性的標(biāo)志物。為了解決PHC的診斷問題，腫瘤標(biāo)志物包括AFP、CA19-9、CA12-5和CEA聯(lián)合用于PHC的診斷已有報(bào)道[5-6]。此外，新的生物標(biāo)志物，例如高爾基體蛋白73(GP73)[7]，glypican-3(GPC-3)[8]和microRNA[9-10]也正在研究中。然而，診斷敏感度和(或)特異度不足限制了這些標(biāo)志物在臨床中的應(yīng)用。

早期研究表明，定量檢測(cè)血漿游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)對(duì)PHC診斷具有價(jià)值[11]。由于cfDNA的定量分析不能提供PHC潛在的分子靶標(biāo)信息，因此近10多年幾乎放棄了對(duì)cfDNA定量檢測(cè)的研究。盡管cfDNA定量分析在肝癌中的應(yīng)用備受爭(zhēng)議，但它具有簡(jiǎn)單、快速和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。隨著技術(shù)的發(fā)展， cfDNA的定量檢測(cè)仍然具有很大的應(yīng)用價(jià)值[12]。

雙鏈DNA (double-stranded DNA，dsDNA)是cfDNA的重要組成部分，復(fù)制壓力引起的DNA斷裂是dsDNA異常產(chǎn)生的重要原因[13]。肝臟作為最大的代謝器官承受巨大的復(fù)制壓力，因此我們推測(cè)血漿dsDNA可能是PHC的標(biāo)志物。本研究探討血漿中游離雙鏈DNA(cell-free double-stranded DNA，cf-dsDNA)在PHC診斷中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

招募2019年5月至10月南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫第二醫(yī)院收治的62例PHC患者、41例良性肝病患者以及45例健康對(duì)照。PHC和良性肝病的診斷主要基于臨床癥狀、影像學(xué)和傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物檢查。按照AFP參考范圍(<9 ng/mL)，62例PHC患者中34例為AFP陰性，28例為AFP陽(yáng)性。PHC的分期根據(jù)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(tumor node metastasis，TNM)分類進(jìn)行。

良性肝病包括膽囊炎7例，膽結(jié)石5例，肝囊腫2例，肝血管瘤11例，病毒性肝炎12例和肝硬化4例。健康對(duì)照的納入標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤標(biāo)志物、肝炎標(biāo)志物和體檢沒有異常。健康個(gè)體的排除標(biāo)準(zhǔn)：曾經(jīng)接受二線治療，患有良性腫瘤、慢性炎性疾病和自身免疫性疾病。收集術(shù)前/治療前患者和健康對(duì)照的清晨空腹外周血。

本研究通過了南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫第二醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核，項(xiàng)目編號(hào)：(2019)倫理審查第(Y-25)號(hào)。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

磁珠法cf-dsDNA提取試劑盒和磁力架(江蘇昱安生物科技有限公司)，Qubit 1×dsDNA HS分析試劑盒和Qubit 3.0熒光計(jì)(美國(guó)Life Technologies公司)。AFP、CA19-9、CA12-5和CEA電發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒和Cobas e602全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀(德國(guó)羅氏公司)。

1.3 cf-dsDNA的定量檢測(cè)

1.3.1 血漿制備 1 900×g離心EDTA抗凝血10 min，收集血漿。再以16 000×g離心10 min。收集血漿，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 cf-dsDNA提取 500 μL血漿中加入1 mL裂解吸附液和10 μL蛋白酶K，1 500 r/min 60 ℃振蕩10 min。加入10 μL磁珠，1 500 r/min室溫振蕩10 min。分離磁珠，洗滌后用25 μL洗脫液洗脫收集cf-dsDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 cf-dsDNA定量 在195 μL Qubit 1×dsDNA HS分析試劑中加入cf-dsDNA提取物5 μL，混勻后避光室溫放置2 min。用Qubit 3.0熒光計(jì)以1 μL讀數(shù)模式檢測(cè)cf-dsDNA濃度。

1.4 血清AFP、CA19-9、CA12-5和CEA水平測(cè)定

2 000×g離心全血30 min，收集血清， -20℃保存?zhèn)溆?。用Cobas e602分析儀測(cè)定AFP、CA19-9、CA12-5和CEA水平，正常參考上限分別為9 ng/mL、35 U/mL、35 U/mL和5 ng/mL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位間距)表示。定量參數(shù)采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或Kruskal-WallisH檢驗(yàn)分析，多組率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析。標(biāo)志物的診斷效率采用受試者工作特征(ROC)曲線分析，選擇約登指數(shù)最大的點(diǎn)作為臨界值，ROC曲線下面積(AUC)采用雙側(cè)95%置信區(qū)間報(bào)告。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物和cf-dsDNA在三組研究對(duì)象中的差異分析

如表1所示，PHC、良性肝病和健康對(duì)照之間，血清AFP、CA19-9、CA12-5、CEA水平均存在顯著差異(P均<0.01)，PHC患者血漿cf-dsDNA水平顯著高于良性肝病和健康對(duì)照者(H=93.54，P<0.01)。

表1 受試者腫瘤標(biāo)志物水平

2.2 血漿cf-dsDNA水平與PHC患者臨床特征的關(guān)系

在PHC患者中，cf-dsDNA水平在年齡、性別、AFP水平、PHC類型以及腫瘤大小之間均無(wú)明顯差異(P均>0.05)，見表2。cf-dsDNA水平與PHC的TNM分期之間存在等級(jí)相關(guān)性，等級(jí)相關(guān)系數(shù)(rs)為0.311(P=0.013 9)。

表2 cf-dsDNA水平與PHC患者臨床特征的關(guān)系

2.3 cf-dsDNA在PHC中的診斷作用

單獨(dú)用于PHC診斷，AFP的AUC為0.742，CA12-5的AUC為0.781，AFP、CA19-9，CA12-5和CEA聯(lián)合診斷的AUC為0.866。cf-dsDNA 診斷PHC的AUC為0.965。cf-dsDNA聯(lián)合AFP診斷的AUC為0.976，cf-dsDNA聯(lián)合所有腫瘤標(biāo)志物診斷PHC的AUC為0.979。見表3和圖1。

表3 各種標(biāo)志物對(duì)PHC的診斷效率

A:傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物和cf-dsDNA；B:cf-dsDNA聯(lián)合不同腫瘤標(biāo)志物圖1 各種標(biāo)志物診斷PHC的ROC曲線

2.4 各標(biāo)志物在PHC中的陽(yáng)性率

根據(jù)表3中各標(biāo)志物的臨界值，cf-dsDNA在PHC中的陽(yáng)性率為90.32%(56/62)，AFP的陽(yáng)性率為45.16%(28/62)，CA19-9的陽(yáng)性率為48.39%(30/62)，CA12-5的陽(yáng)性率為70.97%(44/62)，CEA的陽(yáng)性率為64.52%(40/62)，cf-dsDNA在PHC中的陽(yáng)性率明顯高于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物(χ2=36.00，P<0.01)。而cf-dsDNA在良性肝病和健康對(duì)照中cf-dsDNA的陽(yáng)性率分別為9.76%(4/41)和2.22%(1/45)。cf-dsDNA在肝細(xì)胞癌、膽管癌和混合型PHC中的陽(yáng)性率無(wú)明顯差異(P=0.612 2)，CA19-9和AFP在三者之間的陽(yáng)性率也無(wú)明顯差異，而CA12-5和 CEA陽(yáng)性率在三者之間有顯著差異。見表4。cf-dsDNA聯(lián)合所有傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物在PHC中的陽(yáng)性率為87.10%(54/62)。

表4 各種標(biāo)志物在不同類型PHC中的陽(yáng)性率 例(%)

3 討論

PHC的血液學(xué)診斷是亟待解決的難點(diǎn)，腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷是解決方案之一[5-6]。我們的數(shù)據(jù)顯示，單獨(dú)用于PHC診斷，傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物中CA12-5的診斷效率最高，其AUC為0.781。應(yīng)該注意的是，雖然CA12-5用于PHC診斷的理論效率較高，但是CA12-5的臨界值低于正常參考上限(35 U/mL)，這明顯與臨床應(yīng)用不符。盡管AFP、CA19-9、CA12-5和CEA聯(lián)合診斷PHC的AUC理論上達(dá)到了0.866，但用于診斷的臨界值計(jì)算較為復(fù)雜。除此之外，AFP、CA19-9、CA12-5和CEA還受到例如吸煙、飲酒、血糖水平、年齡、性別、月經(jīng)、懷孕等因素的影響[14-15]。因此，傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)或聯(lián)合不能滿足臨床對(duì)PHC診斷的需求。

血漿dsDNA水平可能是PHC的良好標(biāo)志物[11-12]。本研究中，PHC患者cf-dsDNA水平顯著高于良性肝病患者和健康對(duì)照。cf-dsDNA作為PHC診斷標(biāo)志物的AUC為0.965。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)[16]，我們認(rèn)為cf-dsDNA水平對(duì)PHC具有良好的診斷效率。有研究表明，cfDNA與AFP結(jié)合可以提高PHC的診斷效率[17]。但本研究中，cf-ds-DNA與AFP聯(lián)合或者與所有傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合僅略微提高PHC的診斷效率(AUC分別為0.976和0.979)。與單獨(dú)的cf-dsDNA相比，cf-dsDNA無(wú)論是與CA19-9、CA12-5還是CEA聯(lián)合都不能明顯提高PHC的診斷效率，并且這些聯(lián)合指標(biāo)的AUC、敏感度和特異度與cf-dsDNA單獨(dú)診斷幾乎相同。這一結(jié)果說明，在聯(lián)合指標(biāo)中cf-dsDNA起著至關(guān)重要的診斷作用。

值得關(guān)注的是，cf-dsDNA水平在AFP陰性和陽(yáng)性PHC之間以及在PHC類型之間均無(wú)明顯差異。根據(jù)臨界值判斷，cf-dsDNA在不同類型PHC中的陽(yáng)性率也無(wú)明顯差異，但明顯高于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物。在所有受試者中，PHC患者cf-dsDNA的陽(yáng)性率明顯高于良性肝病和健康對(duì)照。且使用聯(lián)合指標(biāo)不能提高PHC的陽(yáng)性率(87.10%)。上述結(jié)果表明，cf-dsDNA在各種類型PHC中均具有良好的鑒別診斷能力，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的不足。

除了診斷價(jià)值之外，本研究結(jié)果顯示，cf-dsDNA水平與腫瘤大小無(wú)關(guān)，但與TNM分期有關(guān)。這說明cf-dsDNA水平有望用于腫瘤轉(zhuǎn)移的判斷，這個(gè)推論還需要更多樣本的驗(yàn)證。

盡管本研究結(jié)論明確，但仍存在一些局限性。首先，基于ROC分析的臨界值需要獨(dú)立驗(yàn)證。其次，PHC病例數(shù)量不多，因此應(yīng)謹(jǐn)慎看待相關(guān)推論，尤其是與P值略低于0.05的相關(guān)性推論。第三，由于沒有進(jìn)行隨訪，cf-dsDNA在PHC進(jìn)展、預(yù)后和療效評(píng)估中的應(yīng)用尚需進(jìn)一步探討。綜上所述，本研究結(jié)果顯示cf-dsDNA可作為PHC診斷的良好標(biāo)志物，隨著研究的深入，該結(jié)論有望應(yīng)用于臨床。