徐彤， 馮偉偉， 丁陽(yáng)陽(yáng)， 錢顯， 陳瑤， 茆廣華， 仰榴青， 吳向陽(yáng)

(江蘇大學(xué)1. 環(huán)境與安全工程學(xué)院； 2. 化工學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A, TBBPA)是目前使用最為廣泛的一種溴代阻燃劑，各種環(huán)境介質(zhì)如土壤、水體、大氣及生物體中均可檢測(cè)到。已有研究表明，TBBPA可通過(guò)干擾神經(jīng)相關(guān)激素、神經(jīng)遞質(zhì)分泌和神經(jīng)相關(guān)信號(hào)通路產(chǎn)生神經(jīng)毒性[1]。TBBPA的部分結(jié)構(gòu)與甲狀腺激素相似，進(jìn)入生物體血液后可擾亂甲狀腺激素分泌，導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂并進(jìn)一步造成神經(jīng)元損傷[2]。四溴雙酚A雙(2-羥基乙基)醚[TBBPA bis(2-hydroxyetyl) ether，TBBPA-DHEE]是TBBPA典型的衍生物之一，廣泛用于生產(chǎn)工程聚合物、涂料、熱塑性聚酯及聚苯乙烯泡沫等材料，已在水體、土壤等環(huán)境介質(zhì)中檢出[3-4]。其結(jié)構(gòu)與TBBPA母體高度類似，是否具有類似的毒理學(xué)效應(yīng)尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，TBBPA-DHEE對(duì)大鼠嗜鉻瘤細(xì)胞、新生大鼠均具有神經(jīng)毒性[5-6]，而對(duì)水生動(dòng)物的影響尚不清楚。因此，本文以斑馬魚(yú)胚胎為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)胚胎發(fā)育相關(guān)指標(biāo)、行為學(xué)指標(biāo)、酶學(xué)指標(biāo)及Ca2+信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá)的分析，系統(tǒng)研究TBBPA-DHEE暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的神經(jīng)毒性，并探明潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑:TBBPA-DHEE標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司，其余試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)，均為分析純；RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司)；引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)。

主要儀器:體式熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；超低溫冰箱(日本Panasonic公司)；組織勻漿器(德國(guó)IKA公司)；電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；超微量核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Thermo公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(瑞士Roche公司)；斑馬魚(yú)行為分析系統(tǒng)(荷蘭Noldus公司)。

1.2 TBBPA-DHEE溶液的配置

TBBPA-DHEE用二甲基亞砜助溶，配制成27 mmol/L的貯備液避光保存，實(shí)驗(yàn)前用胚胎培養(yǎng)液將貯備液稀釋。根據(jù)環(huán)境相關(guān)濃度，最終暴露濃度設(shè)置低、中、高劑量組分別為0.086 mg/L、0.860 mg/L和8.600 mg/L，各劑量組二甲基亞砜含量均為0.05%(V/V)，并設(shè)置空白對(duì)照組和二甲基亞砜組。

1.3 受試動(dòng)物

親魚(yú)選用AB系斑馬魚(yú)(Daniorerio)，購(gòu)于南京一樹(shù)梨花生物科技有限公司。用海鹽調(diào)節(jié)去離子水電導(dǎo)率至500～530 μS/cm飼養(yǎng)斑馬魚(yú)。魚(yú)房溫度(28.0±0.5)℃，光照周期14 h ∶10 h，每日喂食2次豐年蝦。實(shí)驗(yàn)前一天，將雌雄親魚(yú)按1 ∶1比例放入魚(yú)卵收集缸中；次日早取出隔板，雌雄斑馬魚(yú)自行交配，30 min后收集產(chǎn)下的受精卵，挑選出發(fā)育正常的胚胎用于后續(xù)胚胎暴露實(shí)驗(yàn)。

1.4 斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性

將已暴露的胚胎置于培養(yǎng)箱中，設(shè)置培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件與魚(yú)房一致，暴露至120 hpf(hourpost fenilized，受精后數(shù)小時(shí))，每天更換一半暴露液。自暴露開(kāi)始后每24 h在體式顯微鏡下觀察胚胎和(或)脫膜后幼魚(yú)的死亡、孵化情況，觀察至96 hpf。分別于24、48、72和96 hpf觀察胚胎/仔魚(yú)的畸形情況。48、72 hpf時(shí)置于顯微鏡下觀察胚胎/仔魚(yú)1 min內(nèi)的心跳次數(shù)。96 hpf時(shí)在顯微鏡下測(cè)量仔魚(yú)從頭部最前端到尾尖的長(zhǎng)度(不包括尾鰭)。

1.5 斑馬魚(yú)仔魚(yú)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 自主運(yùn)動(dòng)分析 28～29 hpf時(shí)，在體式顯微鏡下觀測(cè)胚胎1 min內(nèi)的自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)。

1.5.2 仔魚(yú)運(yùn)動(dòng)行為分析 斑馬魚(yú)仔魚(yú)的運(yùn)動(dòng)行為量化用斑馬魚(yú)行為分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。將120 hpf的斑馬魚(yú)仔魚(yú)置于96孔板中，每孔一條魚(yú)測(cè)定其游動(dòng)活性。先將斑馬魚(yú)放進(jìn)行為室中適應(yīng)10 min后，觀察仔魚(yú)對(duì)環(huán)境由黑暗到光明再到黑暗轉(zhuǎn)變(10 min暗—10 min光—10 min暗—10 min光—10 min暗)的響應(yīng)情況，每30 s記錄一次數(shù)據(jù)(包括移動(dòng)頻率、行進(jìn)距離和累計(jì)持續(xù)移動(dòng)時(shí)間)。

1.6 氧化應(yīng)激相關(guān)酶測(cè)定

將斑馬魚(yú)胚胎暴露120 hpf后，加入PBS制成10%的組織勻漿，于4 ℃、2 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至冰浴預(yù)冷的離心管中。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛含量及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活力。

1.7 組織內(nèi)Ca2+及γ-氨基丁酸含量測(cè)定

TBBPA-DHEE暴露120 hpf后，將仔魚(yú)清洗干凈，加入PBS制成10%的組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定其Ca2+含量和斑馬魚(yú)γ-氨基丁酸含量。

1.8 qRT-PCR法測(cè)定Ca2+信號(hào)通路中相關(guān)mRNA表達(dá)

仔魚(yú)暴露120 hpf后，每組隨機(jī)選取30條仔魚(yú)，根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度。取1 μg RNA采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)加入樣品和試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為20 μL，包括1 μL DNA模板及0.2 μL上、下游混合引物；反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸20 s，共55個(gè)循環(huán)；熔融曲線反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。PCR引物設(shè)計(jì)由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)，選取β-actin作為內(nèi)參基因，Cacna1ab、Atp2a1、Atp2a1l、Camk1ga、Calml4a、Ppp3ca、Plcd3a和Prkca的引物設(shè)計(jì)如表1所示。目的基因表達(dá)水平用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算處理。

表1 Ca2+通路相關(guān)基因引物

1.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)形態(tài)的變化

如圖1A所示，與空白對(duì)照組相比，TBBPA-DHEE各劑量組斑馬魚(yú)胚胎死亡率呈上升趨勢(shì)，且8.600 mg/L暴露劑量組顯著上升(P<0.05)。由此可見(jiàn)，TBBPA-DHEE暴露可致斑馬魚(yú)死亡率升高。

如圖1B所示，與空白對(duì)照組相比，72 hpf時(shí)TBBPA-DHEE各暴露劑量組胚胎孵化率呈下降趨勢(shì)，且0.860 mg/L暴露劑量組孵化率顯著下降(P<0.05)；96 hpf時(shí)，0.860 mg/L劑量組孵化率較空白對(duì)照組顯著降低(P>0.05)。由此可見(jiàn)，TBBPA-DHEE暴露可導(dǎo)致胚胎孵化延遲。

如圖1C所示，斑馬魚(yú)胚胎畸形率隨TBBPA-DHEE濃度增加而上升，各暴露劑量組仔魚(yú)出現(xiàn)心包水腫、身體彎曲、游囊關(guān)閉等畸形形態(tài)，且與空白對(duì)照組相比，8.600 mg/L暴露劑量組畸形率顯著上升(P<0.05)。由此可見(jiàn)，TBBPA-DHEE暴露劑量增加可增加仔魚(yú)畸形率，影響其正常發(fā)育。

如圖1D所示，72 hpf時(shí)，隨著暴露劑量升高，心率變化呈倒“U”型變化趨勢(shì)，即低劑量增強(qiáng)心率而高劑量抑制心率，與空白對(duì)照組相比，8.600 mg/L暴露劑量組仔魚(yú)心率顯著降低10.7%(P<0.01)。由此可見(jiàn)，TBBPA-DHEE暴露可致斑馬魚(yú)心臟發(fā)育受損，血液循環(huán)減緩，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸受阻，進(jìn)一步影響斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育。

如圖1E所示，96 hpf時(shí)，各暴露劑量組斑馬魚(yú)仔魚(yú)平均體長(zhǎng)呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，8.600 mg/L暴露劑量組中的斑馬魚(yú)仔魚(yú)平均體長(zhǎng)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)。由此可見(jiàn)，TBBPA-DHEE暴露可顯著抑制仔魚(yú)正常生長(zhǎng)發(fā)育。

A:96 hpf時(shí)斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)的死亡率；B:72和96 hpf時(shí)斑馬魚(yú)胚胎的孵化率；C:96 hpf時(shí)斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)畸形率及畸形形態(tài)；D:48和72 hpf時(shí)斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)的心率；E:96 hpf時(shí)斑馬魚(yú)仔魚(yú)的平均體長(zhǎng)。a: P < 0.05， b: P<0.01，與空白對(duì)照組比較圖1 各組斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)的形態(tài)學(xué)變化

2.2 斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)行為的變化

2.2.1 胚胎早期自主運(yùn)動(dòng)分析 TBBPA-DHEE暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎早期自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)的影響如圖2所示。暴露于0.086、0.860和8.600 mg/L劑量TBBPA-DHEE中的胚胎，其運(yùn)動(dòng)次數(shù)較空白對(duì)照組分別下降44.92%，66.95%和83.90%(P<0.01)。自主運(yùn)動(dòng)是影響胚胎孵化的因素之一，其與胚胎孵化結(jié)果一致。由此表明，TBBPA-DHEE暴露可顯著抑制胚胎早期運(yùn)動(dòng)。

*:P < 0.01，與空白對(duì)照組比較圖2 各組斑馬魚(yú)胚胎的早期自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)

2.2.2 仔魚(yú)的運(yùn)動(dòng)行為分析 圖3A所示，空白對(duì)照組斑馬魚(yú)仔魚(yú)在明暗刺激下，運(yùn)動(dòng)活力呈周期性變化，即開(kāi)燈時(shí)(黑暗轉(zhuǎn)為明亮)仔魚(yú)的運(yùn)動(dòng)活力迅速下降，而關(guān)燈時(shí)(明亮轉(zhuǎn)為黑暗)仔魚(yú)的運(yùn)動(dòng)活力迅速上升，在黑暗條件下仔魚(yú)的平均運(yùn)動(dòng)距離高于光照條件下的平均運(yùn)動(dòng)距離。

圖3B所示，黑暗條件下，0.860和8.600 mg/L暴露劑量組的運(yùn)動(dòng)活力較空白對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，光照條件下各暴露劑量組與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖3C所示，與空白對(duì)照組相比，黑暗期下0.860和8.600 mg/L暴露劑量組仔魚(yú)累計(jì)持續(xù)移動(dòng)時(shí)間顯著降低(P<0.01)，光照期下各暴露劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A:暗—明—暗—明—暗光照周期刺激下斑馬魚(yú)平均游泳距離；B:明暗刺激下相應(yīng)的平均游泳距離；C:光暗周期下斑馬魚(yú)仔魚(yú)累計(jì)持續(xù)移動(dòng)時(shí)間。*:P<0.01，與空白對(duì)照組比較圖3 120 hpf時(shí)各組斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)行為變化

2.3 斑馬魚(yú)體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)酶的變化

如圖4A所示，與空白對(duì)照組相比，各暴露劑量組仔魚(yú)體內(nèi)SOD活力均呈上升趨勢(shì)；0.086和8.600 mg/L暴露劑量組SOD活力分別提高28.48%和20.66%(P<0.01)；0.860 mg/L暴露劑量組SOD活力提高7.90%(P<0.05)。如圖4B所示，與空白對(duì)照組相比，各暴露劑量組斑馬魚(yú)體內(nèi)丙二醛含量呈濃度-效應(yīng)關(guān)系，0.860 mg/L和8.600 mg/L暴露劑量組丙二醛含量分別提高62.68%(P<0.05)和99.56%(P<0.01)。如圖4C所示，120 hpf時(shí)各濃度TBBPA-DHEE暴露劑量組GPx活力與空白對(duì)照組相比呈上升趨勢(shì)，0.860和8.600 mg/L暴露劑量組分別上升111.73%和173.94%(P<0.01)。由此表明，TBBPA-DHEE暴露可造成斑馬魚(yú)仔魚(yú)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，影響斑馬魚(yú)仔魚(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)。

A:斑馬魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)SOD活力；B:斑馬魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)丙二醛含量；C:斑馬魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)GPx活力。a:P<0.05，b:P<0.01，與空白對(duì)照組比較圖4 各組斑馬魚(yú)體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)酶的活性及含量

2.4 斑馬魚(yú)體內(nèi)Ca2+及γ-氨基丁酸含量的變化

圖5A和5B所示，隨著TBBPA-DHEE暴露劑量的增加，斑馬魚(yú)仔魚(yú)Ca2+含量呈上升趨勢(shì)，γ-氨基丁酸含量呈下降趨勢(shì)。與空白對(duì)照組相比，0.860和8.600 mg/L暴露劑量TBBPA-DHEE可顯著增加Ca2+含量，分別升高34.85%和55.79%(P<0.05或<0.01)；各暴露劑量組斑馬魚(yú)仔魚(yú)γ-氨基丁酸含量顯著降低(P<0.05或<0.01)。由此可見(jiàn)，TBBPA-DHEE可顯著增加斑馬魚(yú)體內(nèi)Ca2+含量，降低γ-氨基丁酸含量，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

A:斑馬魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)Ca2+含量；B:斑馬魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)γ-氨基丁酸含量。a:P<0.05，b:P<0.01，與空白對(duì)照組比較圖5 各組斑馬魚(yú)體內(nèi)Ca2+及γ-氨基丁酸的含量

2.5 Ca2+信號(hào)通路中相關(guān)mRNA表達(dá)量的變化

如圖6所示，與空白對(duì)照組相比，0.860 mg/L和8.600 mg/L暴露劑量TBBPA-DHEE均顯著上調(diào)仔魚(yú)Cacna1ab、Atp2a1、Atp2a1l、Camk1ga、Ppp3ca、Plcd3a和Prkca等mRNA表達(dá)(P<0.05或<0.01)；0.086 mg/L暴露劑量TBBPA-DHEE顯著下調(diào)Atp2a1和Plcd3a表達(dá)(P<0.05或<0.01)?？梢?jiàn)，TBBPA-DHEE可顯著影響Ca2+信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá)。

a:P<0.05，b:P<0.01，與空白對(duì)照組比較圖6 各組斑馬魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)Ca2+通路中相關(guān)mRNA表達(dá)量比較

3 討論

斑馬魚(yú)胚胎的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能夠反映斑馬魚(yú)的神經(jīng)元活力。17～29 hpf時(shí)胚胎出現(xiàn)早期自主運(yùn)動(dòng)，其表現(xiàn)為尾巴交替擺動(dòng)。28～29 hpf時(shí)，隨著中樞系統(tǒng)的發(fā)育，胚胎早期自主運(yùn)動(dòng)受到自發(fā)控制，此階段運(yùn)動(dòng)頻率趨于穩(wěn)定[7]。本研究結(jié)果表明，TBBPA-DHEE暴露可顯著抑制胚胎的自發(fā)運(yùn)動(dòng)。在生命早期階段，斑馬魚(yú)仔魚(yú)的運(yùn)動(dòng)行為常作為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的評(píng)價(jià)指標(biāo)，行為受外在環(huán)境干擾，對(duì)環(huán)境污染物比較敏感。本研究結(jié)果表明，TBBPA-DHEE暴露顯著抑制黑暗條件下斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)活力及累計(jì)持續(xù)移動(dòng)時(shí)間，且降低仔魚(yú)對(duì)光暗刺激的敏感性。先前的研究中，200和400 μg/L TBBPA暴露可顯著降低斑馬魚(yú)仔魚(yú)在光照期和黑暗期運(yùn)動(dòng)活力[1]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致，表明TBBPA-DHEE與TBBPA具有相似的神經(jīng)毒性，均對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)神經(jīng)系統(tǒng)造成影響。

氧化應(yīng)激可破壞機(jī)體內(nèi)活性氧與抗氧化系統(tǒng)間的平衡，影響神經(jīng)突觸的可塑性[8]，是引起興奮性毒性的重要因素。氧化與抗氧化系統(tǒng)間的失衡將影響斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育。SOD和GPx作為抗氧化酶，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激中起重要作用。脂質(zhì)過(guò)氧化是氧化損傷的主要表現(xiàn)之一，丙二醛是衡量機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的標(biāo)志性檢測(cè)之一，其含量間接反映膜損傷程度。本研究結(jié)果表明，TBPPA-DHEE暴露顯著增加斑馬魚(yú)體內(nèi)SOD、GPx活力，這可能是一種機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)；丙二醛含量顯著上升，表明TBBPA-DHEE暴露對(duì)機(jī)體造成氧化損傷。Linhartova等[9]發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)暴露于TBBPA中，體內(nèi)SOD活力呈上升趨勢(shì)；左優(yōu)[10]將斑馬魚(yú)暴露在TBBPA中，其體內(nèi)GPx活力顯著升高；Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TBBPA暴露會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)體內(nèi)丙二醛含量顯著增加；本研究結(jié)果均與上述研究類似，表明TBBPA-DHEE與TBBPA具有相似的氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響斑馬魚(yú)仔魚(yú)神經(jīng)系統(tǒng)。

Ca2+作為第二信使，在細(xì)胞信號(hào)傳遞過(guò)程中起重要作用，參與去極化信號(hào)的傳輸和突觸傳遞、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、學(xué)習(xí)記憶等生物過(guò)程[12]。TBBPA-DHEE暴露可誘導(dǎo)斑馬魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)Ca2+含量增加，Ca2+失衡會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、線粒體去極化和細(xì)胞毒性，同時(shí)引起神經(jīng)毒性[13]。過(guò)量的Ca2+內(nèi)流和快速升高可誘導(dǎo)神經(jīng)元不可逆損傷，本研究結(jié)果表明TBBPA-DHEE可破壞機(jī)體內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)。γ-氨基丁酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著TBBPA-DHEE劑量增加，仔魚(yú)體內(nèi)γ-氨基丁酸含量呈下降趨勢(shì)。由此表明，TBBPA-DHEE對(duì)機(jī)體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的攝取產(chǎn)生影響，從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

CaV2.1b(Cacna1ab)由感覺(jué)神經(jīng)元表達(dá)，在細(xì)胞活動(dòng)依賴性神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程中，可將Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)到突觸前末梢[15]。Atp2a1和Atp2a1l調(diào)控的肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶在Ca2+跨膜運(yùn)輸中起重要作用，有助于將Ca2+重新隔離至肌漿網(wǎng)中，促使肌肉放松[16]。本研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，高劑量TBBPA-DHEE暴露顯著上調(diào)Cacna1ab、Atp2a1和Atp2a1lmRNA表達(dá)。Camk1ga調(diào)控的鈣調(diào)素主要存在于脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，富集于突觸后膜、突觸后致密區(qū)及突出囊泡，CAMK屬于鈣調(diào)素激酶家族。當(dāng)Ca2+濃度上升時(shí)，先與鈣調(diào)素結(jié)合，而后激活CAMK[17]。Ppp3ca調(diào)控的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是一種Ca2+鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶，在Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)與細(xì)胞反應(yīng)的耦合中起關(guān)鍵作用[18]，是一種負(fù)性調(diào)控學(xué)習(xí)記憶蛋白，上調(diào)時(shí)可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶受損。Ppp3ca可能與癲癇神經(jīng)發(fā)育障礙有關(guān)。Plcd3a調(diào)控的PLC是磷酸肌醇途徑中的關(guān)鍵酶，通過(guò)生成二?；视秃图〈?,4,5-三磷酸，介導(dǎo)激活蛋白激酶C，且調(diào)節(jié)釋放細(xì)胞內(nèi)的Ca2+；研究發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)退行性疾病和阿爾茨海默病有關(guān)[19]。本研究結(jié)果表明，TBBPA-DHEE暴露誘導(dǎo)Camk1ga、Ppp3ca、Plcd3a和PrkcamRNA表達(dá)上升。由此可見(jiàn)，TBBPA-DHEE暴露可激活斑馬魚(yú)仔魚(yú)鈣信號(hào)通路從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

綜上所述，TBBPA-DHEE暴露可致胚胎/仔魚(yú)死亡率和畸形率升高，延緩胚胎孵化，對(duì)斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)行為產(chǎn)生顯著影響，同時(shí)引起斑馬魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)SOD、GPx活力及丙二醛含量顯著上升，造成氧化損傷，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，可能與TBBPA-DHEE暴露誘導(dǎo)仔魚(yú)體內(nèi) Ca2+含量上升，破壞鈣穩(wěn)態(tài)，抑制攝取γ-氨基丁酸，并影響斑馬魚(yú)仔魚(yú)Ca2+信號(hào)通路相關(guān)mRNA的表達(dá)相關(guān)。