盧峪霞， 李 信， 艾自勝， 梁 萍， 楊長(zhǎng)青

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院消化科·同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院消化疾病研究所，上海 200065； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科，上海 200065；3. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，上海 200092； 4. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200065)

目前，乙肝病毒感染引起的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B， CHB)仍導(dǎo)致沉重的負(fù)擔(dān)： 有傳染性、需長(zhǎng)期治療、難以治愈。如果沒(méi)有及時(shí)有效的治療，疾病將緩慢進(jìn)展，最終發(fā)展為肝硬化、肝衰竭或肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)為15%～40%，是世界性的公共健康威脅。Marshallpo[1]于1998年正式提出了“腸-肝軸”的概念。肝臟和腸道在解剖和生物學(xué)功能上存在密不可分的聯(lián)系，腸道菌群代謝物進(jìn)入體循環(huán)，影響宿主肝臟的功能。基于對(duì)CHB功能性治愈的迫切需要和對(duì)腸-肝軸認(rèn)識(shí)的深入，本研究應(yīng)用16s rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)對(duì)CHB患者腸道菌群的多樣性進(jìn)行分析，旨在比較CHB患者和健康人腸道菌群的差異，探討腸道菌群對(duì)CHB患者疾病的影響及可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年1月—2018年12月在同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科及消化科就診的CHB患者60例糞便樣本，另外收集健康對(duì)照者30例糞便樣本。

入選標(biāo)準(zhǔn)： 年齡18～65歲，參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)及中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年更新版)[2]，符合CHB臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，處于免疫清除期(immune clearance phase)和再活動(dòng)期(reactivation phase)CHB患者60例，其中HBeAg陽(yáng)性慢乙肝34例，HBeAg陰性慢乙肝26例，不伴肝纖維化或肝硬化、肝癌等并發(fā)癥，同時(shí)根據(jù)患者血清ALT、HBVDNA水平和肝臟疾病嚴(yán)重程度，結(jié)合其年齡、家族史等因素，綜合評(píng)估患者疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，達(dá)到抗病毒治療標(biāo)準(zhǔn)，予以入選。

排除標(biāo)準(zhǔn)： (1) 孕婦及哺乳期婦女；(2) 精神病患者；(3) 腫瘤患者；(4) 肝硬化患者；(5) 合并其它肝病及傳染病患者；(6) 合并心、肺、腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者；(7) 合并胃腸道疾??；(8) 入組前曾應(yīng)用或正在應(yīng)用乙肝抗病毒藥物者；(9) 入組前1個(gè)月有使用抗生素及微生態(tài)藥物者；(10) 因各種原因依從性差、不能嚴(yán)格配合治療及按時(shí)隨訪者。

健康對(duì)照組入選要求： 年齡18～65歲，健康體檢正常，排除病毒攜帶者，入組前1個(gè)月未應(yīng)用抗生素及微生態(tài)藥物者。

1.2 研究方法

用FloraPrepTM樣品采集管(蘇州艾達(dá)康醫(yī)療科技有限公司)進(jìn)行糞便采樣，置于4 ℃暫存，2周內(nèi)盡快送檢。應(yīng)用16s rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)檢測(cè)樣本菌群多樣性，實(shí)驗(yàn)流程包括： 對(duì)糞便樣本進(jìn)行DNA的提取與質(zhì)檢、16s rDNA可變區(qū)PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、文庫(kù)制備與檢測(cè)、高通量測(cè)序等多個(gè)步驟。嚴(yán)格質(zhì)控，按照目標(biāo)數(shù)據(jù)量調(diào)整文庫(kù)體積，將多個(gè)文庫(kù)混合后進(jìn)行Illumina MiSeq測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

研究納入CHB患者60例，其中男性35例，女性25例，年齡(42.35±11.04)歲；健康對(duì)照組30例，其中男性15例、女性12例，年齡(41.70±11.46)歲。CHB患者組與健康對(duì)照組性別(χ2=0.023，P=0.880)、年齡(t=0.260，P=0.795)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 CHB患者與健康對(duì)照者腸道菌群OTU

對(duì)測(cè)序得到的每一條序列的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭和低質(zhì)量過(guò)濾處理后，去除嵌合體序列，得到有效序列后再進(jìn)行聚類分析，每一個(gè)聚類稱為一個(gè)OTU。根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果，CHB組與健康對(duì)照組共有644個(gè)OTU，CHB組(Z)獨(dú)有375個(gè)OTU，健康對(duì)照組(C)獨(dú)有66個(gè)OTU，韋恩圖(Venn)見圖1。

圖1 基于OTU的Venn圖Fig.1 Venn diagram of OTU in different groups

健康對(duì)照組獨(dú)有的前10位OTU根據(jù)豐度由高到低有： OTU133(p_Bacteroidetes;c_Bacteroidia;o_Bacteroidales;f_Prevotellaceae;g_Alloprevotella)、OTU431(p_Firmicutes;c_Erysipelotrichia;o_Erysi-pelotrichales;f_Erysipelotrichaceae)、OTU485(p_Pro-teobacteria;c_Betaproteobacteria;o_Burkho-lderiales;f_Alcaligenaceae;g_Sutterella)、OTU284(p_Proteo-bacteria;c_Alphaproteobacteria;o_Rhodospirillales;f_Rhodospirillaceae)、OTU337(p_Bacteroidetes;c_Bacteroidia;o_Bacteroidales;f_Bacteroidaceae;g_Bacteroides)、OTU487(p_Bacteroidetes;c_Bacteroidia;o_Bacteroidales;f_Prevotellaceae;g_Alloprevotella)、OTU396(p_Firmicutes;c_Negativicutes;o_Seleno-monadales;f_Veillonellaceae;g_Mitsuokella)、OTU346(p_Cyanobacteria;c_Melainabacteria;o_Gastra-naerophilales)、OTU286(p_Cyanobacteria;c_Mela-inabacteria;o_Gastranaerophilales)、OTU260(p_Firmi-cutes;c_Clostridia;o_Clostridiales;f_ClostridialesvadinBB60group)。

CHB組獨(dú)有的前10位OTU根據(jù)豐度由高到低有： OTU1120(p_Bacteroidetes;c_Bacteroidia;o_Bacteroidales;f_Bacteroidaceae;g_Bacteroides)、OTU592(p_Firmicutes;c_Clostridia;o_Clostri-diales;f_Ruminococcaceae;g_Ruminococcus)、OTU766(p_Bacteroidetes;c_Bacteroidia;o_Bacter-oidales;f_Bacteroidaceae;g_Bacteroides)、OTU658(p_Firmicutes;c_Clostridia;o_Clostridiales;f_Ruminococcaceae;g_Faecalibacterium)、OTU972(p_Bacteroidetes;c_Bacteroidia;o_Bacteroidales;f_Pre-votellaceae;g_Prevotella9)、OTU801(p_Firmicutes;c_Negativicutes;o_Selenomonadales;f_Veillonellaceae;g_Megamonas)、OTU560(p_Firmicutes;c_Clostridia;o_Clostridiales;f_Lachnospiraceae;g_Blautia)、OTU516(p_Bacteroidetes;c_Bacteroidia;o_Bac-teroidales;f_Rikenellaceae;g_RikenellaceaeRC9gutgroup)、OTU651(p_Actinobacteria;c_Actinobacteria;o_Bifidobacteriales;f_Bifidobacteriaceae;g_Bif-idobacterium)、OTU559(p_Firmicutes;c_Clostridia;o_Clostridiales;f_Lachnospiraceae;g_[Eubacterium]rectalegroup)。

CHB組OTU數(shù)量為(203.00±68.59)個(gè)，健康對(duì)照組為(230±57.08)個(gè)，提示健康對(duì)照組物種更豐富，但經(jīng)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.332)。

2.3 CHB患者與健康對(duì)照者腸道菌群的豐度

各樣本Top的物種分布，分別在 phylum(門)(圖2)、class(綱)(圖3)、order(目)(圖4)、family(科)(圖5)、genus(屬)(圖6)和 species(種)(圖7)不同水平上進(jìn)行分類，統(tǒng)計(jì)各樣本的相對(duì)豐度值，繪制成柱狀圖。

圖2 在門水平各樣本豐度前10位的腸道菌Fig.2 At phylum level top 10 species with high abundance in different samples

圖3 在綱水平各樣本豐度前10位的腸道菌Fig.3 At class level top 10 species with high abundance in different samples

圖4 在目水平各樣本豐度前10位的腸道菌Fig.4 At order level top 10 species with high abundance in different samples

圖5 在科水平各樣本豐度前10位的腸道菌Fig.5 At family level top 10 species with high abundance in different samples

圖6 在屬水平各樣本豐度前10位的腸道菌Fig.6 At genus level top 10 species with high abundance in different samples

圖7 在種水平各樣本豐度前6位的腸道菌Fig.7 At species level top 6 species with high abundance in different samples

2.4 CHB患者與健康對(duì)照者腸道菌群α多樣性指數(shù)分析

α多樣性關(guān)注單樣本的多樣性分析，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)指數(shù)的分析來(lái)估計(jì)物種豐富度和多樣性。以Chao1和Shannon指數(shù)為例，組間差異分析的箱線圖分別見圖8～9。

圖8 Chao1指數(shù)分析腸道菌群組間差異Fig.8 Chao1 index analysis of intestinal flora in different groups

CHB組(Z)的Chao1指數(shù)中位數(shù)為228.5，健康對(duì)照組(C)的Chao1指數(shù)中位數(shù)為263.6，表明健康對(duì)照組腸道菌群的豐富度更高，見圖8。

CHB組(Z)的Shannon指數(shù)中位數(shù)為4.70，健康對(duì)照組(C)的Shannon指數(shù)中位數(shù)為4.72，表明健康對(duì)照組菌群的多樣性更豐富，見圖9。

圖9 Shannon指數(shù)分析腸道菌群組間差異Fig.9 Shannon index analysis of intestinal flora in different groups

2.5 CHB患者與健康對(duì)照者腸道菌群多樣性分析Rank-abundance曲線

兩組Rank-abundance曲線見圖10。在橫軸分布上看，健康對(duì)照組比CHB組相對(duì)較寬，提示健康對(duì)照組物種分布較為豐富；從縱軸分布上看，健康對(duì)照組曲線分布較CHB組平坦，提示健康對(duì)照組物種組成的均勻度相對(duì)較高。

圖10 不同樣本腸道菌群Rank-abundance曲線Fig.10 Rank-abundance curve of intestinal flora in different samples

2.6 不同分類水平CHB患者與健康對(duì)照者腸道菌種分布

在門水平，兩組樣本菌群均以厚壁菌門(Firmi-cutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為主；健康對(duì)照組出現(xiàn)了獨(dú)有的浮霉菌門(Planctomycetes)；梭桿菌門(Fusobacteria)在CHB患者中有出現(xiàn)且均較健康人體內(nèi)的數(shù)量多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.875 125)。

在綱水平，CHB組梭菌綱(Clostridia)多于健康對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.078 921)；CHB組芽孢桿菌綱(Bacilli)多于健康對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 999)；健康對(duì)照組獨(dú)有Melainabacteria和OM190，CHB組沒(méi)有檢測(cè)到。

在目水平，放線菌目(Actinomycetales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)在CHB組中獨(dú)有，Gastra-naerophilales在健康對(duì)照組獨(dú)有；CHB組乳酸菌目(Lactobacillales)多于健康對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 999)；CHB組柄桿菌目(Caulo-bacterales)、脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)、根瘤菌目(Rhizobiales)少于健康對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(依次P=0.000 999、0.045 954、0.000 003 57)。

在科水平，放線菌科(Actinomycetaceae)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)、莫拉氏菌科(Mora-xellaceae)在CHB組中獨(dú)有；CHB組葉桿菌科(Phyllobacteriaceae)、柄桿菌科(Caulobacteraceae)、氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)少于健康對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(依次P=0.000 003 57、0.000 999、0.039 96)；CHB組Defluviitaleaceae、鏈球菌科(Streptococcaceae)、毛螺菌科(Lachno-spiraceae)多于健康對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(依次P=0.000 067 3、0.000 999、0.018 981)。

在屬水平，CHB組和健康對(duì)照組中都含有較多的擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faeca-libacterium)、普氏菌9(Prevotella9)和羅斯氏菌(Roseburia)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(依次P=0.576 424、0.189 81、0.183 816、0.080 919)；CHB組獨(dú)有的屬有理研菌屬(Rikene-llaceae RC9 gut group)、Intestinibacter、活潑瘤胃球菌屬(Ruminococcusgnavusgroup)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、Rumi-nococcusgauvreauiigroup、Flavonifractor、嗜木聚糖真桿菌屬(Eubacteriumxylanophilumgroup)、放線菌屬(Actinomyces)、代爾夫特菌屬(Delftia)、Cateni-sphaera、微單胞菌屬(Parvimonas)、韋榮球菌UCG-007(Erysipelotri-chaceaeUCG-007)；健康對(duì)照組獨(dú)有的屬有微生長(zhǎng)單胞菌屬(Dysgonomonas)、韋榮球菌UCG-004(ErysipelotrichaceaeUCG-004)、短真桿菌(Eubacte-riumbrachygroup)、Faecalicoccus、鄰單胞菌屬(Plesi-omonas)；CHB組毛螺旋菌屬UCG-010(LachnospiraceaeUCG-010)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)少于健康對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(依次P=0.033 966、0.000 003 57)；CHB組瘤胃球菌屬1(Ruminococcus1)、伊格爾茲氏菌屬(Eggerthella)、毛螺旋菌屬NC2004(Lachnosp-iraceaeNC2004group)、毛螺旋菌屬FCS020(Lac-hnospiraceaeFCS020group)、梭菌屬(Clostridiuminnocuumgroup)、DefluviitaleaceaeUCG-011、顫桿菌克屬(Oscillibacter)、Blautia多于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(依次P=0.009 99、0.004 995、0.030 969、0.0119 88、0.027 972、0.000 067 3、0.000 969、0.019 98)。

2.7 CHB患者與健康對(duì)照者腸道菌群聚類分析

使用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)聚類法，基于Brary-Curtis距離矩陣，構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行PCoA(Principal Co-ordinates Analysis)分析，結(jié)果顯示；樣本各自聚集，區(qū)分良好，兩組間僅少數(shù)樣本交叉，但CHB組有8個(gè)樣本偏離較大，獨(dú)自聚集，菌群離散度與健康對(duì)照組相比更大。提示CHB患者總體菌群結(jié)構(gòu)與健康對(duì)照組有顯著差異，不同個(gè)體間腸道菌群離散程度顯著，菌群結(jié)構(gòu)個(gè)體差異大，而健康對(duì)照組菌群結(jié)構(gòu)個(gè)體差異較小，見圖11。

圖11 不同樣本腸道菌群PcoA分析Fig.11 PCoA analysis of intestinal flora in different samples

2.8 CHB患者與健康對(duì)照者腸道菌群組間差異分析

兩組Metastats差異分析見圖12： 目水平差異最大且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的5個(gè)菌種是Rhizobiales、Caulobacterales、Gastranaerophilales、Lactobacillales、Actinomycetales(依次P=0.000 003 57、0.000 999 001、0.000 999 001、0.000 999 001、0.007 992 008)，見圖12。

圖12 Metastats分析腸道菌群組間差異Fig.12 Metastats analysis of intestinal flora in different groups

3 討 論

據(jù)估計(jì)全世界有3.5億慢性乙肝病毒攜帶者[3]，CHB是全球最常見的傳染病之一。HBV感染者不同的臨床結(jié)局是病毒、宿主及環(huán)境相互作用所致。宿主因素包括感染病毒時(shí)的年齡、性別、個(gè)人行為、宿主遺傳因素及腸道微生態(tài)等[4]。

腸道和肝臟有共同的胚胎起源——前腸，腸道淋巴細(xì)胞起源于發(fā)育中的肝臟，成熟后通過(guò)門靜脈和膽道系統(tǒng)相互關(guān)聯(lián)。肝臟和腸道在解剖和生物學(xué)功能上存在密不可分的聯(lián)系。腸道微生物群在宿主代謝和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。腸道微生態(tài)與疾病的關(guān)系正受到越來(lái)越多的關(guān)注[5-6]。

研究[7-19]表明，CHB與腸道微生物群的失調(diào)有關(guān)，并將焦點(diǎn)集中于腸-肝軸，認(rèn)為腸道微生物群的結(jié)構(gòu)變化、細(xì)菌易位和免疫損傷會(huì)影響肝臟炎癥的發(fā)生發(fā)展。腸道菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致肝功能異常、肝脂肪變性和結(jié)締組織重塑等慢性肝病進(jìn)展，其中有炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂等參與[20]。

有研究[21]入組85名低Child-Pugh scores CHB患者及20名健康對(duì)照，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，CHB組菌群有以下變化： 5個(gè)OTU增加，包括Actinomyces、Clostridiumsensustricto、unclassifiedLachnospiraceae和Megamonas；27個(gè)OTU減少，包括Alistipes、Asacc-harobacter、Bacteroides、Butyricimonas、ClostridiumIV、Escherichia/Shigella、Parabacteroides、Ruminococcus、unclassifiedBacteria、unclassifiedClostridiales、Unc-lassifiedCoriobacteriaceae、unclassifiedEnterobacte-riaceae、unclassifiedLachnospiraceae和unclassifiedRuminococcaceae等。另有研究[22]表明，柔嫩梭菌、糞腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸菌，在乙肝后肝硬化患者腸道中有明顯變異。雙歧桿菌和腸桿菌科B/E值，從健康對(duì)照組(1.15±0.11)、無(wú)癥狀攜帶者(0.99±0.09)，CHB患者(0.76±0.08)、肝硬化失代償患者(0.64±0.09)，依次顯著降低(P<0.01)。

傳統(tǒng)的微生物鑒定方法常難以鑒定眾多習(xí)性復(fù)雜的微生物。16s rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)通過(guò)特異性引物擴(kuò)增樣本中原核生物16s rDNA的可變區(qū)特征性核苷酸序列，構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)并對(duì)16s rDNA可變區(qū)序列進(jìn)行分析，從而鑒定樣本中細(xì)菌的多樣性與豐度。本研究應(yīng)用16s rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，對(duì)CHB患者和健康對(duì)照者糞便樣本進(jìn)行DNA提取與質(zhì)檢、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、文庫(kù)制備與檢測(cè)、高通量測(cè)序，比較CHB患者和健康人腸道菌群的差異。

本研究結(jié)果顯示： 在門水平，兩組樣本菌群均以Firmicutes和Bacteroidetes為主；健康對(duì)照組出現(xiàn)了獨(dú)有的Planctomycetes。在綱水平，健康對(duì)照組獨(dú)有Melainabacteria和OM190；Bacilli在CHB組較健康對(duì)照組多(P<0.05)。在目水平，Actinomyce-tales、Pseudomonadales在CHB組中獨(dú)有；Gastran-aerophilales在健康對(duì)照組獨(dú)有；Lactobacillales在CHB組多于健康對(duì)照組(P<0.05)；Caulobac-terales、Desulfovibrionales、Rhizobiales在CHB組少于健康對(duì)照組(P<0.05)。在科水平，Actinomyceta-ceae、Comamonadaceae、Moraxellaceae在CHB組中獨(dú)有；Phyllobacteriaceae、Caulobacteraceae、Acidami-nococcaceae在CHB組少于健康對(duì)照組(P<0.05)；Defluviitaleaceae、Streptococcaceae、Lachnospiraceae在CHB組多于健康對(duì)照組(P<0.05)。在屬水平，CHB組獨(dú)有12個(gè)屬，健康對(duì)照組獨(dú)有5個(gè)屬; CHB組LachnospiraceaeUCG-010、Mesorhizobium少于健康對(duì)照組(P<0.05)；CHB組Ruminococcus1、Egg-erthella、LachnospiraceaeNC2004group、Lachnospir-aceaeFCS020group、Clostridiuminnocuumgroup、Deflu-viitaleaceaeUCG-011、Oscillibacter、Blautia多于健康對(duì)照組(P<0.05)。本研究結(jié)果說(shuō)明，與健康對(duì)照比較，CHB腸道菌群的豐富度、多樣性、均勻度均下降；CHB腸道菌群個(gè)體差異大，健康對(duì)照組個(gè)體差異較小；在不同分類水平，CHB組和健康對(duì)照組有各自獨(dú)有的腸道菌種和差異菌。

CHB病毒導(dǎo)致感染以及肝硬化和肝癌的機(jī)制尚未完全明確。越來(lái)越多研究表明[23]，腸道菌群能調(diào)節(jié)免疫，保護(hù)機(jī)體免受肝炎病毒感染。腸道菌群的潛在免疫作用為乙肝病毒感染的發(fā)病機(jī)制提供了新的研究方向。研究慢乙肝患者腸道菌群的改變，可能為慢乙肝的功能性治愈提供潛在有效的靶向治療手段。但腸道微生態(tài)紛繁復(fù)雜，臨床研究需要投入大量時(shí)間和精力，影響因素較多，數(shù)據(jù)分析繁瑣，要進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制和管理策略，尚需深入研究和大樣本的隨機(jī)對(duì)照臨床研究。