黃思渝， 成 昱， 秦 瑤

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究所，上海 200123； 3. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院干細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)基地，上海 200123)

干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells， ESCs)及各種成體干細(xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞(mese-nchymal stem cells， MSCs)、造血干細(xì)胞(hemo-poietic stem cell, HSCs)、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells， NSCs)、上皮干細(xì)胞(epithelial stem cells， ESCs)、視網(wǎng)膜干細(xì)胞(retina stem cells， RSCs)等，因其治療和再生潛能受到越來越多的關(guān)注。其可能的機(jī)制是干細(xì)胞在移植后遷移到病變或損傷的部位，分化為目標(biāo)細(xì)胞，修復(fù)或替換受損的細(xì)胞或組織。目前，干細(xì)胞療法在很多疑難疾病，如帕金森病[1]、肝衰竭病[2]、修復(fù)缺血和梗死肢體組織[3]以及心肌梗死[4]等的治療中已顯現(xiàn)出良好的臨床前效果。需要指出的是，由于缺乏對(duì)移植干細(xì)胞的在體示蹤手段，干細(xì)胞移植到體內(nèi)后的存活、遷移以及增殖分化過程并不清楚，導(dǎo)致其治療過程尚在黑箱之中，治療效果也很難明確界定。因此，發(fā)展有效的、適用于移植干細(xì)胞的活體示蹤技術(shù)對(duì)干細(xì)胞療法的臨床推進(jìn)有重要意義。

正如分子探針的發(fā)展催生了分子影像學(xué)的出現(xiàn)與發(fā)展一樣，基于現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)影像設(shè)備及成像方法，適用于移植干細(xì)胞的活體示蹤技術(shù)的發(fā)展將更多依賴于先進(jìn)的干細(xì)胞示蹤劑的開發(fā)。理想的干細(xì)胞活體示蹤劑應(yīng)該具備以下特點(diǎn)： (1) 示蹤劑必須是安全的，即示蹤劑不能干擾細(xì)胞的關(guān)鍵屬性；(2) 示蹤劑必須能穩(wěn)定標(biāo)記細(xì)胞足夠時(shí)間，即示蹤劑能夠在干細(xì)胞的作用周期內(nèi)準(zhǔn)確指示干細(xì)胞的位置；(3) 示 蹤劑能靈敏指示干細(xì)胞的活死；(4) 示蹤劑能指示干細(xì)胞的增殖以及分化情況，即干細(xì)胞的功能情況。這些特點(diǎn)給現(xiàn)有醫(yī)學(xué)影像技術(shù)及未來干細(xì)胞活體示蹤劑的研發(fā)提出了巨大的挑戰(zhàn)。現(xiàn)有的譜系示蹤技術(shù)雖然能反映干細(xì)胞的活死狀態(tài)，但其標(biāo)記過程必須經(jīng)過基因改造工程輔助，這制約了其臨床轉(zhuǎn)化。而其他示蹤技術(shù)則普遍存在不能有效反映移植干細(xì)胞的活死以及分化和功能情況。

近年來，納米技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展為干細(xì)胞活體示蹤技術(shù)的發(fā)展提供了新的思路?；诩{米技術(shù)制備的顆粒，如熒光量子點(diǎn)、超順磁納米粒子以及金納米顆粒等，其納米尺度的直徑及結(jié)構(gòu)賦予其穩(wěn)定優(yōu)異的光電子學(xué)、磁學(xué)等性能，可作為外源性標(biāo)記物標(biāo)記細(xì)胞，分別用于干細(xì)胞的光學(xué)成像、磁共振/磁粒子成像及光聲成像等。這類具有成像功能的納米粒子統(tǒng)稱納米示蹤劑。納米粒子作為示蹤劑的優(yōu)點(diǎn)除了更穩(wěn)定、優(yōu)異的成像性能之外，還體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： (1) 可以通過控制制備方法及技術(shù)方便地調(diào)變示蹤劑的成像性能，如熒光量子點(diǎn)的發(fā)光波長(zhǎng)可以從紫外紅移至近紅外區(qū)；(2) 可 以通過耦合或修飾的方法方便地對(duì)納米示蹤劑進(jìn)行功能集成，使具備多模態(tài)成像功能或者結(jié)合分子影像探針進(jìn)行細(xì)胞的功能成像。已有一些探索性的工作將基于納米顆粒的干細(xì)胞標(biāo)記與其他標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，用于監(jiān)測(cè)治療過程中移植干細(xì)胞的位置、遷移、存活和分化，顯示出納米示蹤劑用于干細(xì)胞治療的巨大潛力。本文將按成像方法分類，介紹各種示蹤標(biāo)記技術(shù)尤其是納米示蹤劑在移植干細(xì)胞活體示蹤中的應(yīng)用進(jìn)展，并重點(diǎn)關(guān)注那些可以對(duì)干細(xì)胞的活死及分化功能狀態(tài)進(jìn)行示蹤的工作。

1 基于光學(xué)成像的干細(xì)胞活體示蹤

1.1 熒光量子點(diǎn)結(jié)合報(bào)告基因技術(shù)示蹤干細(xì)胞活死

光學(xué)成像技術(shù)是一種經(jīng)典的活體成像技術(shù)，具有無創(chuàng)、高靈敏度、特異度、低成本等特點(diǎn)。基于報(bào)告基因標(biāo)記技術(shù)的光學(xué)成像被較早地用于干細(xì)胞的示蹤。報(bào)告基因標(biāo)記需要在干細(xì)胞移植前，用攜帶有報(bào)告基因的質(zhì)粒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或慢病毒載體轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，使細(xì)胞表達(dá)特異性酶、受體或蛋白，因?yàn)閷?dǎo)入的基因只能在活細(xì)胞中表達(dá)，所以它的檢測(cè)可以推斷細(xì)胞的活性。但明顯的，報(bào)告基因技術(shù)由于轉(zhuǎn)染步驟的存在對(duì)干細(xì)胞損傷較大。且由于用于光學(xué)成像的報(bào)告基因一般是一些熒光蛋白[5]及熒光素酶[6]的基因，其發(fā)光區(qū)間一般落在可見光區(qū)，存在光穿透能力有限、發(fā)光壽命有限等缺陷。相比報(bào)告基因標(biāo)記技術(shù)，基于納米熒光量子點(diǎn)的標(biāo)記技術(shù)屬于外源性標(biāo)記技術(shù)。成像前，通過簡(jiǎn)單的共孵育實(shí)現(xiàn)熒光量子點(diǎn)對(duì)干細(xì)胞的標(biāo)記，然后被標(biāo)記的干細(xì)胞移植到活體后經(jīng)過激發(fā)光激發(fā)，由高靈敏度的CCD捕獲發(fā)射光子，實(shí)現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞的示蹤。納米量子點(diǎn)相比生物熒光材料具有壽命長(zhǎng)、光學(xué)信號(hào)穩(wěn)定、發(fā)光光譜范圍窄并且可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)。但其發(fā)光仍需要外源的激發(fā)，因此也存在背景信號(hào)干擾問題，同時(shí)由于其組成為無機(jī)材料的特點(diǎn)，也無法直接對(duì)干細(xì)胞在活體內(nèi)的活死狀態(tài)進(jìn)行反映。目前,有研究者將熒光素酶與量子點(diǎn)進(jìn)行偶聯(lián),利用生物發(fā)光的自發(fā)冷光作為激發(fā)光,通過發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)方式使得量子點(diǎn)發(fā)射光信號(hào)。這種復(fù)合成像技術(shù)既能夠利用熒光素酶特異指示細(xì)胞活性的特性,又能利用量子點(diǎn)優(yōu)良的發(fā)光特性，還能克服其需要外源激發(fā)光的問題,是一種可高靈敏度、有效示蹤干細(xì)胞分布及細(xì)胞活性的光學(xué)成像技術(shù)。Ma等[7]以熒光素酶為模板，通過生物礦化合成了Luc8-PbS近紅外量子點(diǎn)，用該探針標(biāo)記干細(xì)胞,移植活體后,注射熒光素底物,利用熒光素酶氧化底物發(fā)光激發(fā)量子點(diǎn),發(fā)射具有更高組織穿透能力的近紅外熒光,來對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤。這種成像技術(shù)無需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因改造,目前已成功應(yīng)用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的標(biāo)記和活體示蹤。Huang等[8]通過將Ag2S量子點(diǎn)、紅色螢火蟲熒光素酶(RFLuc)和Ⅰ型膠原啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶(GLuc)結(jié)合起來，設(shè)計(jì)了一種復(fù)合納米光學(xué)探針： Ag2S的近紅外二區(qū)(NIR-Ⅱ)熒光成像有利于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells， hMSCs)的定位，RFLuc和GLuc的生物發(fā)光成像可以分別用于實(shí)時(shí)報(bào)告hMSCs的活性和成骨分化，從而幫助了解移植的hMSCs與顱骨缺損部位的細(xì)胞外微環(huán)境之間的相互作用及干細(xì)胞促進(jìn)骨再生的治療機(jī)制。所以，基于生物發(fā)光-近紅外量子點(diǎn)的偶聯(lián)復(fù)合納米材料有希望成為符合體內(nèi)干細(xì)胞示蹤要求的示蹤劑結(jié)合光學(xué)成像用于臨床應(yīng)用。只是目前量子點(diǎn)的發(fā)光效率普遍偏低[9]，發(fā)光光譜需要進(jìn)一步紅移來改善成像深度，熒光素酶和量子點(diǎn)之間能量轉(zhuǎn)移效率也有待提高，這些方面可能是該類探針開發(fā)將來要有所針對(duì)的努力方向。

1.2 熒光量子點(diǎn)結(jié)合響應(yīng)性熒光分子示蹤干細(xì)胞功能

借用生物傳感器的設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)對(duì)干細(xì)胞死亡或分化功能關(guān)聯(lián)的特異性分子響應(yīng)的化學(xué)/生物顯像反應(yīng)結(jié)合到示蹤探針上，是一種解決干細(xì)胞死活以及功能示蹤的有效方法。Li等[10]制備了負(fù)載siRNA的上轉(zhuǎn)換熒光@多孔氧化硅(UCNP@MSN)復(fù)合納米粒子，用于干細(xì)胞標(biāo)記和近紅外光控釋放siRNA。納米顆粒中負(fù)載的siRNA釋放促進(jìn)了干細(xì)胞的成骨分化。此外，他們還通過對(duì)基質(zhì)金屬肽酶13(MMP13酶)響應(yīng)的多肽將聚集誘導(dǎo)發(fā)光(agg-regation-induced emission, AIE)探針分子連接到復(fù)合納米粒子表面。結(jié)果，成骨細(xì)胞特異性表達(dá)的MMP13酶通過裂解MMP13多肽觸發(fā)了AIE探針的釋放，從而在560 nm處產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此，這類多功能復(fù)合納米粒子探針不僅可以促進(jìn)干細(xì)胞定向分化，而且可以通過光學(xué)成像監(jiān)測(cè)干細(xì)胞的分化情況，為干細(xì)胞治療及機(jī)制研究提供了新的思路。

2 基于MRI的干細(xì)胞活體示蹤

2.1 報(bào)告基因技術(shù)結(jié)合MRI用于干細(xì)胞示蹤

相比于光學(xué)成像,MRI具有更高的組織穿透深度和分辨率,同時(shí)又可以獲得解剖和生理信息。鑒于報(bào)告基因技術(shù)的特點(diǎn)，結(jié)合了報(bào)告基因技術(shù)的MRI使在活體深層組織評(píng)估細(xì)胞存活、遷移和分化成為可能[11]。其原理為干細(xì)胞通過轉(zhuǎn)染報(bào)告基因表達(dá)含鐵的蛋白質(zhì)，提供內(nèi)源性MRI對(duì)比度[12]，或者在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與外源MRI探針反應(yīng)的蛋白，以增強(qiáng)MRI信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞的活體示蹤[13]。近年來，研究者們已經(jīng)開發(fā)了幾種MRI報(bào)告基因，如β-半乳糖苷酶[14]、酪氨酸酶[15]、鐵基轉(zhuǎn)鐵蛋白受體[16]、鐵蛋白[11]等，其中，鐵蛋白是一種細(xì)胞內(nèi)鐵存儲(chǔ)蛋白，由24個(gè)重(H)和輕(L)亞基組成，可存儲(chǔ)和釋放鐵以維持鐵穩(wěn)態(tài)[17]。鐵蛋白的過表達(dá)通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)而捕獲過量的細(xì)胞內(nèi)鐵[18]，因此導(dǎo)致T2弛豫時(shí)間的明顯縮短，從而通過MRI信號(hào)檢出。鑒于鐵蛋白的生物相容性，此技術(shù)具有干細(xì)胞活體示蹤的臨床應(yīng)用潛力[19]。最近，Zhang等[20]采用鐵蛋白作為報(bào)告基因，標(biāo)記植入梗死心臟的干/祖細(xì)胞，并通過對(duì)其體內(nèi)MRI信號(hào)進(jìn)行定量評(píng)估，跟蹤移植到心臟中干細(xì)胞的存活，生長(zhǎng)和遷移。Lim等[21]采用攜帶鐵蛋白MRI報(bào)告基因、熒光成像報(bào)告基因、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的慢病毒載體轉(zhuǎn)染NSCs，然后將之移植到患有急性缺血性中風(fēng)的大鼠健康紋狀體中后，進(jìn)行了雙模態(tài)MRI和FLI成像，追蹤移植細(xì)胞的分布和遷移長(zhǎng)達(dá)4周。然而,MRI報(bào)告基因的成像也存在一些缺陷,如不確定在細(xì)胞死亡后鐵蛋白復(fù)合物的降解速度和MRI信號(hào)的持續(xù)時(shí)間,同時(shí)活體檢測(cè)的靈敏度也較低。所以在評(píng)估細(xì)胞活死的過程中仍存在一定的不確定性。

2.2 磁性納米粒子標(biāo)記結(jié)合MRI用于干細(xì)胞活體示蹤

超順磁性氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles， SPIONs)是一類直徑<10 nm的鐵氧化物納米顆?；蛴蛇@種納米顆粒組成的簇狀物。因?yàn)镾PIONs顆粒的直徑極小，每個(gè)顆粒接近單個(gè)磁疇，當(dāng)對(duì)其施加外場(chǎng)時(shí)，整個(gè)顆?？梢匝刂粋€(gè)方向排列，具有很高的磁化強(qiáng)度；撤去外場(chǎng)時(shí)，熱擾動(dòng)又足以破壞這個(gè)排列使顆粒失去磁性，此即其所具有的超順磁性。鑒于其顆粒直徑及表面修飾策略，SPIONs一般具有很好的水溶性和穩(wěn)定分散性。SPIONs中未成對(duì)電子自旋產(chǎn)生的局部磁場(chǎng)能夠顯著影響鄰近水分子質(zhì)子橫向弛豫時(shí)間T2值的變化，因此是陰性增強(qiáng)MRI造影劑。且相對(duì)于釓基MRI信號(hào)增強(qiáng)劑，SPIONs具有更好的生物相容性、更高的馳豫率、可降解性、更長(zhǎng)的體內(nèi)留存時(shí)間及磁控靶向性等特點(diǎn)，近年來被廣泛用于標(biāo)記干細(xì)胞。作為一種簡(jiǎn)單有效的外源性標(biāo)記策略，在動(dòng)物模型上，SPIONs結(jié)合MRI已被用于ESCs[22]、BMSCs[23]、NSCs[24]等類型干細(xì)胞移植后的體內(nèi)示蹤。麥筱莉等[25]用聚賴氨酸修飾的SPIONs體外標(biāo)記骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞，并觀察標(biāo)記細(xì)胞移植至小鼠缺血性腦梗死模型后的遷移情況。行原位MRI并以普魯士藍(lán)染色輔助觀察標(biāo)記細(xì)胞的遷移情況。MRI結(jié)果顯示，標(biāo)記細(xì)胞腦內(nèi)移植1周后，移植區(qū)信號(hào)改變，并沿胼胝體向病灶側(cè)遷移，和普魯士藍(lán)染色結(jié)果一致。盡管如此，SPIONs外源性標(biāo)記法用于干細(xì)胞的MRI示蹤仍有其不足之處。如隨細(xì)胞分裂，SPIONs標(biāo)記信號(hào)會(huì)被稀釋直至最終失去示蹤作用；更關(guān)鍵的是，單純SPIONs標(biāo)記也不能即時(shí)反映移植干細(xì)胞的存活及功能發(fā)揮狀況，所標(biāo)記移植細(xì)胞已經(jīng)凋亡后，仍有MRI信號(hào)被檢測(cè)到，不符合干細(xì)胞體內(nèi)示蹤的真正要求。鑒于此，Scharf等[26]使用SPIONs和熒光蛋白雙重標(biāo)記BMSCs，然后跟蹤其移植入肌腱損傷的大動(dòng)物模型體內(nèi)后的活性及增殖狀況。結(jié)果證明以質(zhì)量濃度為25或50 μg/mL的SPIONs標(biāo)記細(xì)胞時(shí)，干細(xì)胞的標(biāo)記率分別為95%和94%，且細(xì)胞活性不受明顯影響；標(biāo)記細(xì)胞的代謝活動(dòng)和增殖能力與未標(biāo)記的細(xì)胞無明顯差異。MRI顯示，在肌腱注射部位，第7天開始出現(xiàn)信號(hào)缺失。Ngen等[27]提出使用MRI雙對(duì)比技術(shù)來實(shí)現(xiàn)對(duì)移植干細(xì)胞遷移及活/死狀態(tài)的監(jiān)測(cè)。他們用SPIONs[T2造影劑，鐵含量為(14.8±1.7)pg/cell]和基于釓的螯合物GdDTPA[商品名： 馬根維顯，T1造影劑，釓含量為(3.3±0.2)pg/cell]對(duì)hMSCs進(jìn)行雙重標(biāo)記，在活細(xì)胞中，兩種造影劑都被包裹在有限的細(xì)胞空間中，彼此緊密接觸，標(biāo)記細(xì)胞將產(chǎn)生明顯的T2/T2*對(duì)比度，而釓螯合物的T1對(duì)比度被湮滅。一旦細(xì)胞死亡，移植細(xì)胞的質(zhì)膜就會(huì)破裂，小直徑、快速擴(kuò)散的釓螯合物同SPION分離，在死細(xì)胞附近產(chǎn)生T1增強(qiáng)信號(hào)。通過監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞附近T1信號(hào)的變化可以在活體中監(jiān)測(cè)干細(xì)胞的活死狀態(tài)。當(dāng)然這種方法也有一些局限性。如GdDTPA從死細(xì)胞中釋放后清除很快，所以成像時(shí)間點(diǎn)對(duì)于獲得準(zhǔn)確的讀數(shù)非常重要。且由于釓螯合物本來就是低靈敏度的MRI顯影劑，這種方法適合于造影劑會(huì)迅速積聚到可檢測(cè)水平的急性細(xì)胞死亡情況。值得一提的是，此前雖然有學(xué)者對(duì)SPIONs納米粒子在活體中長(zhǎng)時(shí)間存在可能會(huì)釋放鐵離子引發(fā)一定毒性有擔(dān)憂，但目前也有一些研究證實(shí)這個(gè)問題可以通過控制SPIONs劑量及在SPIONs納米粒子表面進(jìn)行一些有效修飾或者包覆來解決。

2.3 CEST造影劑結(jié)合MRI用于干細(xì)胞活體示蹤

化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移(chemical exchange satu-ration transfer， CEST)是一種新型MRI技術(shù)，與一般意義MRI增強(qiáng)劑基于改變水質(zhì)子弛豫時(shí)間不同，CEST造影劑基于自身被激發(fā)飽和的質(zhì)子與周圍游離水中未被飽和的質(zhì)子間化學(xué)位移不同而發(fā)生交換，引起磁共振信號(hào)改變來產(chǎn)生對(duì)比圖像的。由于質(zhì)子間的交換速率與組織微環(huán)境的pH值之間存在直接聯(lián)系，因而可以通過CEST-MRI信號(hào)間接對(duì)活體組織進(jìn)行pH值成像。關(guān)鍵的是，CEST造影劑可以是外源性小分子和金屬螯合物，也可以是內(nèi)源性蛋白質(zhì)、多肽、葡萄糖或多糖分子，因而有更好的生物相容性。由于細(xì)胞的生理狀態(tài)(病理或者死亡)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)及微環(huán)境pH值的變化,通過開發(fā)合適的CEST造影劑，CEST-MRI可被用于示蹤移植干細(xì)胞的生理狀態(tài)。Chan等[28]報(bào)道了一種基于多聚L-精氨酸(具有多個(gè)可交換NH質(zhì)子的分子)的pH值敏感型CEST造影劑，用于在體監(jiān)測(cè)移植肝細(xì)胞的存活狀況。他們將聚精氨酸做成納米脂質(zhì)體，然后跟移植細(xì)胞封裝在藻酸鹽凝膠微球中,整體移植到肝臟組織中。微球中移植細(xì)胞死亡會(huì)引起pH值從正常的7.3左右下降到6.0左右,納米脂質(zhì)體CEST試劑中精氨酸發(fā)生質(zhì)子交換的速率對(duì)這個(gè)pH值變化敏感而隨之下降，產(chǎn)生可被檢測(cè)的CEST-MRI信號(hào)，從而可以利用MRI系統(tǒng)即時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)移植細(xì)胞的活性檢測(cè)。此示蹤平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)⒁浦布?xì)胞的生存信號(hào)與高分辨解剖學(xué)成像信息結(jié)合起來,生物相容性好，有較好的臨床轉(zhuǎn)化潛能。但其不足之處在于并不能很好地反映移植后細(xì)胞的增殖過程。研究則將報(bào)告基因技術(shù)和CEST-MRI技術(shù)結(jié)合起來，將單純皰疹病毒-1型胸苷激酶(HSV1-tk)報(bào)告基因標(biāo)記的MSCs與CEST-MRI探針5-methyl-5,6-dihydrothymidine(5-MDHT)共培養(yǎng)，然后移植到豬的心臟組織中，利用CXCL12對(duì)HSV1-tk基因表達(dá)的驅(qū)動(dòng)作用及HSV1-tk對(duì)5-MDHT探針分子的召集作用這條關(guān)系鏈，通過CEST-MRI間接反映干細(xì)胞分泌CXCL12促進(jìn)心肌修復(fù)的情況，巧妙地用CEST-MRI技術(shù)示蹤了移植干細(xì)胞的活死及功能狀況[29]。此項(xiàng)示蹤技術(shù)若結(jié)合前面Chan等[28]的納米脂質(zhì)體技術(shù)，將獲得更好的成像分辨率，具有好的在體干細(xì)胞示蹤臨床應(yīng)用價(jià)值。

3 基于超聲成像的干細(xì)胞活體示蹤

超聲成像(ultrasound imaging， US)技術(shù)利用探頭發(fā)射超聲波于組織上并接收回波數(shù)據(jù)來成像，由于不同組織的聲阻抗和衰減特性有差異，經(jīng)過不同組織的回波強(qiáng)度就產(chǎn)生了對(duì)比差異，因而成像能反映組織結(jié)構(gòu)。US幾乎無創(chuàng)且有良好的時(shí)空分辨率和較好的組織穿透深度，是可用于干細(xì)胞的活體示蹤的影像技術(shù)[30]。超聲造影劑是在US中用來增強(qiáng)圖像對(duì)比度的物質(zhì)。一般為微米級(jí)直徑的包膜微氣泡，通過靜脈注射進(jìn)入血管后，可以改變組織的超聲特性(如背向散射系數(shù)、衰減系數(shù)、聲速及非線性效應(yīng))產(chǎn)生造影效果，其增強(qiáng)效果取決于超聲造影劑的濃度、直徑以及超聲發(fā)射頻率。1984年，F(xiàn)einstein等[31]發(fā)明了白蛋白包裹氣泡形成的超聲造影劑，此后基于氣泡的超聲造影劑研究得以快速發(fā)展。這類超聲造影劑一般在空氣氣泡周圍包裹白蛋白、脂類或多糖等，作為膜穩(wěn)定劑。最近20年，新型的氣泡型超聲造影劑氣體多為由氟碳類低彌散度、大相對(duì)分子質(zhì)量的氣體，氣泡的直徑也更小，即微泡超聲造影劑。微泡的直徑一般約幾微米，由一層厚度為幾十納米的膜包裹，膜的彈性及韌性也有所改進(jìn)，穩(wěn)定性得以提高，可直接標(biāo)記干細(xì)胞[32]。但微泡造影劑始終還是因?yàn)橹睆酱?相對(duì)細(xì)胞而言)、氣泡壽命短等問題不能很好地適用于干細(xì)胞的穩(wěn)定示蹤。這種情況下，基于剛性納米材料的超聲造影劑出現(xiàn)了。剛性顆粒和組織界面的聲阻抗差別較大使得納米顆粒可以顯著增強(qiáng)標(biāo)記干細(xì)胞的US信號(hào)。重要的是，與傳統(tǒng)的基于脂質(zhì)或蛋白質(zhì)氣泡的US造影劑相比，剛性納米粒子在長(zhǎng)期和穩(wěn)定地進(jìn)行干細(xì)胞追蹤方面顯示出更大的優(yōu)勢(shì)。Jokerst等[33]發(fā)現(xiàn)通過籠蛋白和肌動(dòng)蛋白內(nèi)吞，二氧化硅納米顆粒(300 nm)可以用來標(biāo)記hMSCs顯著增強(qiáng)US信號(hào)(大約是未標(biāo)記細(xì)胞的7倍)。US的檢測(cè)下限為70 000個(gè)細(xì)胞，大大低于基于釓標(biāo)記的MRI的檢測(cè)限(250 000個(gè)細(xì)胞)，表明US具有更高的靈敏度，有助于提高干細(xì)胞移植治療的精準(zhǔn)性。Chen等[34]報(bào)道了一種具有凹面介孔結(jié)構(gòu)類外泌體形貌的二氧化硅納米顆粒(exosome-like silica， ELS)。這些ELS納米顆粒的凹面介孔結(jié)構(gòu)對(duì)超聲波具有“多重散射/反射”效應(yīng)，從而能夠顯著提高其回聲能力，使之成為性能優(yōu)異的US造影劑。顆粒合成中引入的TSPA(一種含有胺基的硅源)，不僅利于外泌體形貌的形成，而且使ELS表面帶有正電荷，增強(qiáng)了其與干細(xì)胞的親和力。ELS納米顆粒標(biāo)記干細(xì)胞后，可以通過US實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)測(cè)移植干細(xì)胞。當(dāng)然，ELS納米顆粒因其多孔的特性，還可以負(fù)載細(xì)胞因子等，從而提高移植干細(xì)胞的存活率[35]。此外，這些ELS顆粒很容易被化學(xué)修飾，可以在表面連接放射性核素或釓離子，成為多模態(tài)示蹤劑?？傊?，硅基納米粒子因其良好的生物安全性和可設(shè)計(jì)的多孔特性，跟超聲造影技術(shù)結(jié)合后，有潛力成為干細(xì)胞活體示蹤向臨床轉(zhuǎn)化的示蹤劑。今后可通過多孔結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及表面改性進(jìn)一步提高硅基納米粒子的干細(xì)胞標(biāo)記及US示蹤能力。

4 基于光聲成像的干細(xì)胞活體示蹤

光聲成像(photoacoustic imaging， PAI)的原理基于光聲效應(yīng)： 近紅外激光以脈沖(1～100 ns)形式照射到目標(biāo)介質(zhì)/組織上，介質(zhì)吸收光后產(chǎn)生熱彈性膨脹，能量以機(jī)械波的形式釋放,即光聲信號(hào)。光聲信號(hào)攜帶了介質(zhì)的光吸收特征信息，通過探測(cè)光聲信號(hào)能重建出介質(zhì)各部分的光吸收分布圖像。因此，光聲成像結(jié)合了純光學(xué)成像的高選擇性和純超聲成像的深穿透優(yōu)點(diǎn)，可得到高分辨率和高對(duì)比度的組織圖像，從原理上避開了光散射的影響，突破了高分辨率光學(xué)成像深度“軟極限”。PAI的成像設(shè)備易于操作，能夠以實(shí)時(shí)和非侵入性方式提供功能和解剖信息[36]?？紤]到光聲轉(zhuǎn)化效率，幾種在近紅外波長(zhǎng)有強(qiáng)吸收的小分子染料，如FDA批準(zhǔn)的ICG和其他近紅外花箐染料被用于PAI，但它們存在易光漂白和水溶性較差的問題[37]。為了解決這些問題，各種基于納米粒子的PAI探針已在動(dòng)物模型上用于示蹤移植細(xì)胞[38]。Kim等[39]用聚賴氨酸(poly-L-lysine, PLL)修飾的普魯士藍(lán)納米粒子(Prussian blue nanoparticles-PLL, PB-PLL)有效標(biāo)記了hMSCs。PB-PLL納米粒子在730 nm光激發(fā)下有很強(qiáng)的PAI信號(hào)，能夠?qū)π∈竽X中hMSCs的移植過程進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)14 d的成像示蹤。此外，PB-PLL標(biāo)記的hMSCs在小鼠模型上的檢測(cè)限為200 cells/μL，低于二氧化硅包裹的金納米棒的檢測(cè)限(約1 300 cells/μL)。此方法可定量評(píng)估到達(dá)靶點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量，但仍不能反映其植入后的存活狀態(tài)。為解決這個(gè)問題，Dhada等[40]通過將金納米棒與對(duì)活性氧類(ROS)敏感的染料IR775c相結(jié)合，開發(fā)了一種基于納米顆粒的復(fù)合PAI造影劑，標(biāo)記干細(xì)胞并追蹤其活性。在該體系中，IR775c在795 nm處的PAI信號(hào)隨介質(zhì)中活性氧濃度的增加呈線性下降，而金納米棒在920 nm處保持成像穩(wěn)定性，與ROS濃度無關(guān)。因此，通過對(duì)795 nm和920 nm兩處信號(hào)進(jìn)行定量比較，可以獲得移植MSCs的即時(shí)活性?？傮w而言，隨著PAI系統(tǒng)和基于納米顆粒的PAI造影劑的發(fā)展，使用實(shí)時(shí)PAI對(duì)移植干細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確和非侵入性檢測(cè)可以提高其治療效果，從而推動(dòng)干細(xì)胞治療的發(fā)展。

5 基于多模態(tài)成像技術(shù)的干細(xì)胞活體示蹤

鑒于現(xiàn)有的示蹤技術(shù)(包括影像技術(shù)及造影劑)都各有其優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)，沒有一種完全滿足前面提到的干細(xì)胞活體示蹤的所有要求。如譜系示蹤/報(bào)告基因技術(shù)結(jié)合光學(xué)成像雖然成熟且屬于極少的能實(shí)時(shí)體現(xiàn)干細(xì)胞活死狀態(tài)并能抗傳代稀釋的技術(shù)之一，但該技術(shù)使用前提是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，因此不滿足干細(xì)胞活體示蹤的安全性要求。且光學(xué)成像技術(shù)空間分辨率及成像深度也非常有限。而多模態(tài)示蹤將不同的造影技術(shù)聯(lián)合使用，使不同成像技術(shù)形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，不同來源的成像信息相互印證補(bǔ)充。尤其當(dāng)示蹤劑本身可以集成多種成像功能時(shí)，用于細(xì)胞標(biāo)記可以使研究結(jié)果更為精確可信和全面，有望最終達(dá)到干細(xì)胞活體示蹤的要求。目前多模態(tài)成像用于示蹤干細(xì)胞活死狀態(tài)及功能的工作并不多，下面就列舉一些有代表性的工作。

5.1 PET結(jié)合MRI

如上文所述，因MRI增強(qiáng)造影劑超順磁氧化鐵納米粒子低毒、高靈敏度、磁控靶向性以及MRI成像大的穿透深度和高分辨率的特點(diǎn)，基于SPIONs的MRI仍然是目前干細(xì)胞示蹤研究的主要對(duì)象之一[41]。而基于SPIONs的MRI不能滿足的方面，如，對(duì)干細(xì)胞活性及功能的示蹤，可以由其他示蹤手段來互補(bǔ)。正電子發(fā)射斷層顯像(positron emi-ssion tomography， PET)是一種先進(jìn)的臨床核醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)，是唯一可在活體上顯示生物分子代謝、受體及神經(jīng)介質(zhì)活動(dòng)的新型影像技術(shù)。其成像原理： 將生物生命代謝中必需的物質(zhì)，如葡萄糖、蛋白質(zhì)、核酸、脂肪酸等標(biāo)記上短壽命的放射性核素(18F、11C等)，并作為造影劑注入活體，然后通過跟蹤造影劑的代謝過程及分布，來反映組織和器官的功能情況。如以18F標(biāo)記的脫氧葡萄糖為PET造影劑時(shí)，根據(jù)大部分惡性腫瘤組織中葡萄糖代謝旺盛、聚集較多的特點(diǎn)，PET能通過圖像對(duì)早期的腫瘤病變進(jìn)行診斷[42]。但PET成像缺乏解剖學(xué)信息，且其較低的空間分辨率會(huì)使細(xì)胞的準(zhǔn)確定位變得困難；此外，所應(yīng)用的示蹤劑半衰期有限，限制了它們作為長(zhǎng)期細(xì)胞示蹤劑的使用[43]。PET和MRI雙模態(tài)造影不僅可以提供具有高軟組織對(duì)比度的解剖學(xué)信息，還可以對(duì)組織中標(biāo)記的移植細(xì)胞進(jìn)行高靈敏度成像及特定功能示蹤。有研究開發(fā)了18F標(biāo)記的Fe3O4@Al(OH)3納米顆粒作為安全細(xì)胞示蹤劑在PET-MRI雙模態(tài)同步成像中的應(yīng)用： 早期使用PET快速、簡(jiǎn)便地定位和量化納米粒子及標(biāo)記干細(xì)胞MSCs，而MRI則提供高分辨率的解剖學(xué)信息和長(zhǎng)期跟蹤[44]。Higuchi等[45]對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞分別進(jìn)行了碘鈉轉(zhuǎn)運(yùn)基因和氧化鐵納米粒子標(biāo)記，以通過124I-PET和MRI結(jié)合顯像，對(duì)移植的HEPC的定位、存活以及心臟的形態(tài)學(xué)信息進(jìn)行示蹤。報(bào)告基因的表達(dá)提供關(guān)于存活細(xì)胞數(shù)量的特異性信息，鐵氧體納米粒子標(biāo)記提供組織形態(tài)學(xué)信息，此雙模態(tài)方法可對(duì)細(xì)胞定位和活性進(jìn)行互補(bǔ)分析。

5.2 光學(xué)成像結(jié)合MRI

用于光學(xué)成像的熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合SPIONs-MRI的多模態(tài)成像也可用于移植干細(xì)胞的活體示蹤。Lim等[46]制備了含有SPIONs和近紅外熒光染料Cy5.5的殼聚糖復(fù)合納米粒子探針標(biāo)記MSCs，以實(shí)現(xiàn)近紅外熒光-T2加權(quán)MRI雙模成像引導(dǎo)的細(xì)胞示蹤。首先他們用四乙酰化的N-疊氮乙酰-d-甘露糖胺(Ac4ManNAz)處理hMSCs，通過糖工程在其表面生成疊氮(-N3)基團(tuán)。然后，通過體外點(diǎn)擊化學(xué)方法對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行復(fù)合納米探針標(biāo)記。與單一納米粒子標(biāo)記技術(shù)相比，這種復(fù)合標(biāo)記方法可大大提高細(xì)胞標(biāo)記的效率、安全性和成像靈敏度。在中風(fēng)小鼠模型中，經(jīng)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射復(fù)合標(biāo)記的hMSCs，采用雙模成像引導(dǎo)進(jìn)行精確追蹤，實(shí)現(xiàn)了對(duì)標(biāo)記hMSCs從植入部位到腦卒中病變?yōu)槠?4 d的遷移追蹤。研究開發(fā)了一種基于商用SPIONs Feru-moxytol和響應(yīng)Caspase-3釋放熒光的復(fù)合納米粒成像探針，用于干細(xì)胞的MRI和響應(yīng)熒光成像[47]。基于Ferumoxytol的MRI可以實(shí)時(shí)觀察干細(xì)胞移植到小鼠顱骨缺損后的空間分布；Caspase-3響應(yīng)熒光基團(tuán)則有助于檢測(cè)移植后因早期免疫排斥引起的干細(xì)胞死亡。這種雙模態(tài)成像示蹤有助對(duì)干細(xì)胞治療過程進(jìn)行及時(shí)的矯正干預(yù)。

6 干細(xì)胞示蹤的挑戰(zhàn)和未來

綜上，基于納米材料獨(dú)特的納米尺度效應(yīng)(如超順磁性)、納米集成效應(yīng)(可以修飾各種功能分子、偶聯(lián)其他成像模態(tài)的分子)，好的成像靈敏度、結(jié)構(gòu)和化學(xué)穩(wěn)定性以及標(biāo)記效率等方面的優(yōu)勢(shì)，納米示蹤劑結(jié)合各種成像方式已在移植干細(xì)胞的活體示蹤，尤其是最具挑戰(zhàn)性，也是最關(guān)鍵的干細(xì)胞活死示蹤及遷移、分化功能示蹤上取得了一些進(jìn)展。治療的動(dòng)物模型也涉及了中風(fēng)、心肌梗死、骨損傷及神經(jīng)系統(tǒng)損傷等疾病?；谶@些工作，人們對(duì)移植干細(xì)胞在體的命運(yùn)轉(zhuǎn)歸已有初步了解，也發(fā)現(xiàn)了一些重要問題，如存活時(shí)間短、定植率低等。但跟干細(xì)胞治療機(jī)制更相關(guān)的干細(xì)胞在體分化、增殖及功能發(fā)揮等情況卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠明確。而且目前沒有一種基于納米材料的干細(xì)胞示蹤劑獲得FDA的批準(zhǔn)。所以，一方面干細(xì)胞示蹤劑的研發(fā)有迫切的臨床需求，另一方面納米示蹤劑要真正轉(zhuǎn)化為臨床所用，還面臨很多挑戰(zhàn)。

首先，作為外源性標(biāo)記物，無論是用于光學(xué)、MRI還是PET成像的納米示蹤劑都未能克服隨細(xì)胞傳代而濃度被逐漸稀釋的問題。移植干細(xì)胞在體內(nèi)增殖分化后，標(biāo)記上去的納米示蹤劑會(huì)隨著干細(xì)胞的增殖或細(xì)胞胞吐而逐漸被稀釋，最終達(dá)不到成像需要的濃度而失去示蹤能力。其次，除部分商品化的SPIONs，目前對(duì)各種納米示蹤劑生物安全性的研究?jī)H限于體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。標(biāo)記有納米示蹤劑的移植干細(xì)胞在生物體中的代謝途徑、生物分布和長(zhǎng)時(shí)間生物效應(yīng)還沒有得到系統(tǒng)的研究。因此，就生物安全性這方面，納米示蹤劑離臨床應(yīng)用也有較長(zhǎng)的路要走。最后，對(duì)于確定成分的示蹤材料，其顆粒大小、形貌、表面性質(zhì)等都會(huì)影響其標(biāo)記效率、細(xì)胞毒性、降解率和在體內(nèi)的存留時(shí)間。因此在設(shè)計(jì)納米示蹤劑時(shí)，為了獲得更好的生物相容性和標(biāo)記、示蹤能力，需要更全面深入地考慮納米粒子合成策略及表面改性策略，然后再對(duì)其示蹤能力及生物效應(yīng)作相應(yīng)評(píng)估和定論。

按照文章開頭提出的移植干細(xì)胞活體示蹤要求，干細(xì)胞示蹤劑的未來發(fā)展應(yīng)該在以下方面： (1) 多 模態(tài)示蹤仍然是必然趨勢(shì)。鑒于干細(xì)胞活體示蹤對(duì)細(xì)胞存活、增殖、分化、遷移各方面的要求，只有將各種標(biāo)記技術(shù)/成像模式結(jié)合起來取長(zhǎng)補(bǔ)短才有可能部分或全部滿足這些要求。如雖然報(bào)告基因標(biāo)記技術(shù)對(duì)干細(xì)胞的影響一直都飽受詬病，但目前只有這種標(biāo)記技術(shù)能抗傳代稀釋且同時(shí)能反映細(xì)胞的存活狀況。鑒于目前基因轉(zhuǎn)染技術(shù)也在不斷改進(jìn)提高其安全性和轉(zhuǎn)染/表達(dá)效率,未來基于報(bào)告基因標(biāo)記技術(shù)的多模態(tài)示蹤必然還是很多研究者選擇的研究方向。MRI的安全性、高軟組織分辨率及深度優(yōu)勢(shì)也是別的成像模式無法替代的，基于CEST成像原理的MRI示蹤劑因其更好的生物安全性及細(xì)胞微環(huán)境pH值示蹤能力而值得采用。(2) 設(shè) 計(jì)基于生物傳感原理的響應(yīng)型示蹤劑很有必要。移植干細(xì)胞的死亡或正常分化必然伴隨一些特異性分子的釋放，只要找到了可對(duì)這些分子響應(yīng)的化學(xué)/生物顯像反應(yīng)并結(jié)合到示蹤探針上，便會(huì)成為解決干細(xì)胞死活以及功能示蹤的有效方法。而生物傳感器在過去幾十年的發(fā)展中已經(jīng)積累了豐富的對(duì)待測(cè)分子響應(yīng)的化學(xué)/生物檢測(cè)原理可以供干細(xì)胞示蹤劑的設(shè)計(jì)借用，如基于對(duì)Caspase-3響應(yīng)發(fā)光的策略可以報(bào)告干細(xì)胞的死亡。(3) 基于納米集成策略設(shè)計(jì)多功能示蹤平臺(tái)也是有必要的。從現(xiàn)有研究來看，移植干細(xì)胞在體內(nèi)存活時(shí)間仍然較短，定植及分化效率較低，因此，賦予納米示蹤劑磁性，利用外磁場(chǎng)幫助干細(xì)胞在靶部位定植，以及在納米示蹤劑中引入合適的生長(zhǎng)因子和其他生物活性物質(zhì)以增強(qiáng)被標(biāo)記干細(xì)胞活性、定向分化和遷移都是在設(shè)計(jì)新型多功能示蹤平臺(tái)時(shí)值得考慮的策略。